[发明专利]从矛头蝮蛇蛇毒提取的血凝酶及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种从矛头蝮蛇蛇毒(Bothrops atrox)中提取的血凝酶，本发明还提供了所述血凝酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：将矛头蝮蛇蛇毒预处理后，依次经过二乙氨基乙基交联葡聚糖凝胶A‑25离子交换层析；苯甲脒琼脂糖凝胶4FF(HS)亲和层析；以及交联葡聚糖凝胶G‑75凝胶过滤层析；得到矛头蝮蛇蛇毒血凝酶。本发明还提供了一种矛头蝮蛇蛇毒血凝酶在制备用于治疗出血病症的药物中的应用。与现有技术相比，本发明的制备工艺步骤少，周期短，减少过程环境暴露风险；产品收率高，工艺去除杂质能力强，能够获得收率35％以上、纯度98％以上的矛头蝮蛇血凝酶；工艺稳定性高，产品质量一致性好，利于临床用药安全。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种从矛头蝮蛇蛇毒提取血凝酶，本发明还涉及从矛头蝮蛇蛇毒提取血凝酶的方法及该血凝酶的用途。

背景技术

凝血是复杂的生理过程，大体分为三个阶段：第一阶段，凝血因子X(coagulationfactor X，FX)激活；第二阶段，凝血酶原激活；第三阶段，纤维蛋白原变为纤维蛋白。

从蛇毒中提取止血药具有悠久的历史。目前，临床应用较为成功的有瑞士生产的止血药Reptilase，即立止血，它的主要成分是从巴西蛇(Bothrops Jrarace,Lachesisatrox)的毒液中提取的蛇毒类凝血酶(Snake Venom Thrombin-like Enzyme，SVTLE)，该酶属于胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶，具有精氨酸酯酶和酰胺酶活性。该酶在体外可将纤维蛋白原水解为纤维蛋白，而不需要其他凝血因子的参与，在体内不激活凝血因子ⅩⅢ，形成的纤维蛋白凝块不稳定，易于被纤溶系统溶解，从而不影响血小板的激活和释放，不具有血栓形成危险。由于类凝血酶在结构和功能上与人凝血酶相似，故称为“类凝血酶”。迄今为止，已经在30多种蛇毒中发现类凝血酶，并成功分离纯化了20余种，其中10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明(郑颖，沈居仁，张富强等，尖吻蝮蛇血凝酶N末端序列测定及其止血活性分析[J].中国医科大学学报)。

由于天然蛇毒中提取的类凝血酶绝大多数为酸性蛋白质，因此多采用阴离子交换柱进行分离，并结合凝胶过滤、亲和层析和反相液相色谱等方法纯化。

在已报道的文献中，蛇毒类凝血酶的提取纯化方法包括：

1)将蛇毒预处理后，进行二乙氨基乙基-葡聚糖凝胶A50(DEAE-Sephadex A50)阴离子交换层析和分子筛Sephadex G 100层析分离。该工艺预处理过程烦琐，造成酶活性成份损失较多，影响产品的比活力和收率，且在预处理中用到苯酚及其衍生物、甲醇等有机溶剂，影响后期的纯化，不适于规模化生产。

2)将蛇毒预处理后，进行肝素-溴化氰-琼脂糖凝胶4B(Heparin-CNBr-Sepharose4B)亲和层析分离。该工艺预处理方法虽较前法略简单，但在预处理中同样用到苯酚的衍生物，且工艺活性收率较低，仅为7.4％，不适于规模化生产。

申请号为200610044594.1的中国专利申请公开了一种从矛头蝮蛇蛇毒中提取单一成分巴曲酶的方法。其公开了矛头蝮蛇蛇毒经溶解、过夜、离心、Benzamidine Sepharose6B亲和层析、Sephadex G-25层析、透析、(SP Sepharose、S Sepharose或CM Sepharose)阳离子柱层析和(Sephacry1S200、Sephacry1S100或Superdex-75)分子筛层析纯化得到单一组分巴曲酶。但是该专利层析步骤繁琐、其中阳离子柱采用阶段梯度洗脱或直线梯度洗脱，不利于大规模生产中热源与杂质去除。