[发明专利]从矛头蝮蛇蛇毒提取的血凝酶及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种血凝酶，所述血凝酶来源于矛头蝮蛇蛇毒，具有以下特征：

1)血凝酶分子量为31731Da，去糖后分子量为25575Da，N-糖含量为19.4％，3个N-糖基化位点分别为N₉₈、N₁₄₆与N₂₂₅；

2)等电点为5-6；

3)血凝酶N端序列为：VIGGDECDINEHPFL；

4)血凝酶包含6对二硫键，无自由巯基；

5)血凝酶蛋白序列含232个氨基酸；

优选地，所述血凝酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPQYFCGMTLINQEWVLTAAHCDKTYMRIYLGIHTRSVANDDEVIRYPKEKFICPNKKKNVITDKDIMLIRLNRPVKNSTHIAPISLPSNPPSVGSVCRIMGWGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAKTLCAGVLQGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCAEPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCPP。

2.一种从矛头蝮蛇蛇毒提取血凝酶的方法，所述方法包括以下步骤：

将矛头蝮蛇蛇毒预处理后，依次经过二乙氨基乙基交联葡聚糖凝胶(DEAE SephadexA-25)离子交换层析；苯甲脒琼脂糖凝胶4FF(HS)(Benzamidine Sepharose 4FF(HS))亲和层析；以及交联葡聚糖凝胶(Sephadex G-75)凝胶过滤层析，得到矛头蝮蛇蛇毒血凝酶原液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将矛头蝮蛇蛇毒溶于pH 7.0-7.5、0.01M-0.05M的Tris-HCl缓冲液，得到浓度为50-200mg/ml，优选地为80-150mg/ml，更优选地为100mg/ml的溶液，然后离心取上清液；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4，浓度为0.02M；

优选地，所述离心的条件为：4℃下，3000rpm-5000rpm，离心时间为5-20min，优选地为10min；

2)将步骤1)得到的上清液进行DEAE Sephadex A-25离子交换层析，使用含有0.2M-0.4M NaCl的、pH为7.0-7.5、浓度为0.01M-0.05M的Tris-HCl缓冲液直线洗脱，根据280nm波长下的吸收峰收集，得到包含凝血活性组分的洗脱液；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4，浓度为0.02M；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液所含NaCl的浓度为0.3M；

3)将步骤2)得到的包含凝血活性组分的洗脱液用含有0.5M-1.5M NaCl的、pH为7.0-7.5、浓度为0.01-0.06M的Tris-HCl缓冲液透析，再进行Benzamidine Sepharose 4FF(HS)亲和层析，使用含有0.05-0.3M精氨酸、0.5M-1.5M NaCl、pH为7.0-7.5、浓度为0.01-0.06M的Tris-HCl缓冲溶液洗脱，收集目标组分；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.0，浓度为0.05M；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液所含精氨酸的浓度为0.1M；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液所含NaCl的浓度为1.0M；

4)将步骤3)收集的目标组分经Sephadex G-75凝胶过滤层析，使用pH7.0-7.5，浓度为0.05M-0.3M的磷酸盐缓冲液洗脱后，收集洗脱液，得到矛头蝮蛇蛇毒血凝酶原液；

优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，浓度为0.1M。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，在进行DEAE Sephadex A-25离子交换层析之前，使用pH 7.0-7.5、浓度为0.01M-0.05M的Tris-HCl缓冲液平衡3个柱体积；

优选地，柱流速为0.8-3ml/min，更优选地为2ml/min；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4，浓度为0.02M。