[发明专利]利用甲醇的产油酵母工程菌株构建方法及工程菌和应用

说明书

本发明公开了一种利用甲醇的产油酵母工程菌株的构建方法及其应用。本发明的菌株构建方法涉及在产油酵母中同时过表达甲醇利用的关键酶—甲醇脱氢酶、己糖磷酸合酶和磷酸己糖异构酶。所得到的基因工程菌能高效利用甲醇生产油脂，为甲醇转化成长碳链燃料和功能化学品提供核心技术，具有广泛工业应用前景。

技术领域

本发明涉及在产油酵母中构建甲醇利用途径的方法及所得基因工程菌株的应用，属于生物技术和生物能源领域。

背景技术

油脂是一类氧含量低、能量密度高、富含碳氢元素的天然可再生资源，是液体生物燃料、油脂化工品、食品和材料等生产的基础原料，广泛应用于日常生产、生活各个方面(Jin MJ et al.Trends Biotechnol,2015,33(1):43-54.)。传统动、植物油脂产量有限，难以满足日益增长的需求，亟待发展油脂生产新技术。为解决油脂来源问题，利用工业生物技术采用产油酵母如圆红冬孢酵母(R.toruloides)、斯达氏油脂酵母(L.starkeyi)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、弯曲隐球酵母(C.curvatus)等，以碳水化合物或木质纤维素水解液、废甘油等为原料(Huang C et al.Biotechnol Adv,2013,31(2):129-39.)，或者培养产油微藻固定和转化CO₂生产油脂，已成为研究热点(Khoo HH etal.Bioresour.Technol.2013,143:298-307.)。然而，生物质原料复杂，预处理过程冗长、成本高，微藻培养密度低等瓶颈，阻碍了微生物油脂生产技术的产业化。

甲醇能量密度高、来源广、价格低廉、可以利用多种原料---特别是煤炭进行合成，能够保证稳定供给，作为微生物碳源用于生产碳链较长的化合物具有特殊优势，已受到生物技术领域研究的高度关注(McCann DM,et al.Angew Chem Int Ed Engl,2008,47(28):5179-5182.)。此外，利用煤炭或合成气生产甲醇用于生物转化还能够促进化石资源的清洁利用，具有较好的经济、环境和社会效益。

目前通过代谢工程或合成生物学策略改造微生物，以甲醇为碳源生产的化学品有氨基酸、1,5-戊二胺、聚氨等(Brautaset T et al.Appl Microbiol Biotechnol,2007,74:22-34；Schneider J and Wendisch VF.Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:17-30；Schrader J et al.Trends Biotechnol,2009,27:107-115.)。但目前无甲醇为碳源生产油脂的报道。已知的甲醇转化途径共有4种：1.核糖单磷酸途径；2.二羟丙酮途径；3.丝氨酸途径和4.甲醇缩合循环途径(Bogorada IW et al.PNAS,2014,111(45):15928-15933.)。其中甲醇缩合循环途径避开了中心代谢途径，碳的理论得率达到100％，用作甲醇转化策略具有明显优势。

近年来产油酵母的系统生物学研究取得了长足进展，对脂质代谢网络的分子机制有比较深入的认识，为理性改造奠定了科学基础(Zhu ZW et al.Nat.Commun,2012,3:3112.)。通过代谢工程或合成生物学策略改造产油酵母生产油脂及油脂衍生物得以实现。

天然的甲醇利用菌不积累油脂，天然的油脂生产菌株不能利用甲醇为底物。经检索，目前未见有使用代谢工程改造的产油酵母利用甲醇为底物生产油脂的报道。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种能利用甲醇生产油脂的产油酵母菌株的构建方法。

本发明的第二个目的是提供一种利用甲醇生产油脂的产油酵母菌株的用途。

本发明在产油酵母中构建甲醇利用途径，并利用所得基因工程菌株将甲醇转化为油脂，从而提供一条新的油脂生产路线。相对于从植物中提取油脂，或将碳水化合物及木质纤维素资源转化为油脂，以甲醇为碳源生产油脂，能有效降低成本，降低CO₂排放，避免与民争粮、与粮争地的困境。