[发明专利]可同时检测单核增生李斯杆菌、金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的多重PCR检测方法

说明书

本发明根据单核细胞增多性李斯杆菌的hlyA基因，金黄色葡萄球菌的NUC基因与屎肠球菌的ddl基因分别设计引物，建立了能够同时检测这三种病原菌的多重PCR方法。该方法能够特异性的扩增单核细胞增多性李斯杆菌，金黄色葡萄球菌和屎肠球菌DNA片段，其最低检测量分别为、1.07pg、11.6pg和1.21pg。该方法对其他常见的致病菌无交叉反应。本发明所建立的多重PCR反应具有特异性强、敏感性高的特点，为临床上单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的快速检测，鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法。

技术领域

本发明涉及一种多重PCR检测方法，尤其是一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR检测方法。

背景技术

单核细胞增多性李斯杆菌病为人畜共患病，可引起皮肤感染、胃肠道紊乱，败血症。单核细胞增多性李斯杆菌主要是通过肠道感染，从肠道进入后第一侵害的靶器官是肝。在肝中单核细胞增多性李斯杆菌能大量繁殖，直到机体细胞免疫反应增强后才停止。单核细胞增多性李斯杆菌与结核菌、弓形虫虫体类似可以降低动物母体的细胞免疫的机能，从而使动物孕期母体出现免疫缺陷而导致怀孕动物或人出现早产流产现象、损害神经系统(脑炎、脑膜炎)。感染单增性李氏杆菌动物的死亡率高达7％以上。

金黄色葡萄球菌同样为人畜共患病，不仅为患病动物携带该菌，在健康动物的体内也可分离到具有致病毒素的菌株。金黄色葡萄球菌可导致动物组织部位化脓，也能引起动物产生肺炎等疾病。由于该细菌感染的动物在产生败血症后还会继发性的引起脑膜炎，尤其多见于合并左心内膜炎的患者，通过细菌栓子经血流侵袭脑膜。

肠球菌可引起人和动物感染，且屎肠球菌的感染率呈逐年上升趋势。肠球菌本身具有较强的耐药性，不易治愈，此病原菌已受到兽医临床工作者的重视。且单核细胞增多性李斯杆菌，金黄色葡萄球菌与屎肠球菌均可引起动物脑炎。

在内蒙古中部地区一些羊场发生的以脑炎症状为主的感染病例中，分离得到脑源性金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯杆菌与屎肠球菌临床分离株。临床中单核细胞增多性李斯杆菌引起的动物脑炎病例较为常见，但由金黄色葡萄球菌、屎肠球菌引起动物脑炎病例较为少见。到目前为止，兽医临床对该病的诊断主要依靠病原的分离、鉴定，但是由于病原种类较为复杂，特别是李斯杆菌属的细菌种类较多，鉴定存在步骤繁琐、时间长等缺点，并且对单核细胞增多性李斯杆菌的分菌、试验具有较高的风险性，因此，建立快速、特异的PCR诊断方法对于该病的早期确诊和治疗具有重要的临床价值。

目前，国内外针对这三种菌建立的多重PCR检测方法尚未见报道。本试验根据单核细胞增多性李斯杆菌Hyl基因与金黄色葡萄球菌NUC基因、屎肠球菌ddl基因序列设计其特异性引物，建立鉴别检测的多重PCR方法，为开展由金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯杆菌、屎肠球菌单一或混合感染性脑炎的快速鉴别诊断提供新的方法。

本发明根据三种菌株的特异性基因设计引物，能够在多重或单一感染的病料中同时检测到这三种或鉴别其中单一病原，从而为本地区提供了一种可以快速诊断由此三种病原菌多重或单一感染的多重PCR检测方法。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在上述问题，提供一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR检测方法。

本发明根据单核细胞增多性李斯杆菌Hyl基因、屎肠球菌ddl基因、金黄色葡萄球菌NUC基因，分别设计了1对特异性引物，在确定引物最佳浓度等反应体系的条件下，进一步确定了多重PCR扩增程序，由此建立了能够实现对单核细胞增多性李斯杆菌鉴定、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌同时检测或单一鉴别的多重PCR方法。

本发明提供用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR引物，引物针扩增的基因分别为单增性李斯杆菌Hyl基因、屎肠球菌ddl基因、金黄色葡萄球菌NUC基因，其特征如下：