[发明专利]利用特异性引物对紫背浮萍Sp6微卫星标记检测的方法

权利要求书

1.利用特异性引物对紫背浮萍Sp6微卫星标记检测的方法，其特征在于：检测方法如下：

1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；

2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e 1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；

3）设计特异性引物：微卫星位 点Sp6特异性引物：

F: GAACCTTAATATGCGACCAAG

R: CAAGAAAGTCAAATACAGCGG；

4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；

5）对PCR产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp6核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；

所述步骤1）中采集紫背浮萍样品，驯养3~5天；

所述步骤2）中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，60~68℃保温30~60min，每隔10min颠倒混匀；

所述步骤2）DNA提取法为改良的CTAB法；

所述步骤2）中h将沉淀物用65~75%乙醇漂洗，离心，弃上清液；

所述步骤2）中j提取产物取2~3μl用1 .0~2 .0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余在-10~-30℃条件下保存备用；

所述步骤2）中a在60~70℃水浴锅中预热CTAB提取液，所述CTAB提取液由以下成分及重量份组成：CTAB 3~5份、1M Tris-HCl 18~22份、NaCl 14~18份、0.5M EDTA 6~10份、1， 10-菲啰啉0.02~0.08份、2-巯基乙醇0.2~1份、EDTA铁钠0.03~0.06份、氯仿90~98份、异戊醇3~5份。

2.根据权利要求1所述的利用特异性引物对紫背浮萍Sp6微卫星标记检测的方法，其特征在于：所述步骤5）中先将PCR产物进行琼脂糖初筛，选择扩增的PCR产物加上样缓冲液，92~95℃变性8~12min后于5~7%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析。

3.根据权利要求1所述的利用特异性引物对紫背浮萍Sp6微卫星标记检测的方法，其特征在于：所述步骤5）中的上样缓冲液由以下成分及重量份组成：二甲酚橙0.05~0.18份、柠檬黄0.1~0.25份、溴酚蓝0.01~0.05份、二甲苯青FF 0.05~0.18份、羧甲基淀粉钠0.02~0.06份、丙三醇35~37份、番茄红素0.01~0 .02份、乙二胺四乙酸二钠2.8~3.2份、烷醇酰胺0.04~0.08份、十二烷基硫酸钠3~5份。