[发明专利]一种基于免标记分子信标的级联扩增DNA机器及应用

说明书

本发明公开了一种基于免标记分子信标的级联扩增DNA机器及应用，级联扩增DNA机器包括T7 Exo、RMB和SMB，该RMB和SMB含有凸出的5’末端，保护其不受T7 Exo切割。首先，端粒酶延伸TS引物，产生含有串联重复序列(TTAGGG)_n的TEP。然后，TEP与RMB杂交，活化了此DNA机器，展开RMB使其含有平或凹的5’末端，使其失去保护，引发T7 Exo的循环切割，释放完整的TEP和大量DNA片段(引发DNA)，实现一级扩增。接着，引发DNA特异性打开SMB，并被T7 Exo循环，释放大量G4序列，实现二级扩增。最终，TEP和释放的G4序列与NMM发生强烈相互作用，共同产生明显增强的荧光。

技术领域

本发明涉及一种基于免标记分子信标的级联扩增DNA机器及应用。

背景技术

人类端粒酶是由端粒酶RNA(hTR)和端粒酶反转录酶组成的核糖核蛋白反转录酶。端粒酶通过三步过程：hTR绑定到端粒DNA的3’末端、核苷酸合并、延伸的DNA链分离使合成终止或迁移产生又一循环的DNA合成，负责在端粒的3’端添加串联重复序列。端粒酶功能对于细胞的增殖和分化具有重要作用，其活性的增强可导致细胞的持续分裂乃至永生化。大多数人类癌症表达高端粒酶活性，而正常体细胞表达出低端粒酶活性。端粒酶活性的灵敏检测对癌症诊断和抗癌药物发展具有重要意义。

端粒酶活性的传统检测方法是基于聚合酶链式反应(PCR)的端粒重复序列扩增协议(TRAP)。然而，TRAP中的放射性危害和不易定量的电泳结果限制了其广泛应用。除此之外，提出了许多免PCR的等温扩增分析方法用于端粒酶活性的检测。特别地，由于荧光法的安全性、简单性，发展了多种基于荧光的分析方法。这些分析方法中，核酸酶辅助的信号扩增由于具有高扩增效率吸引了广泛关注。核酸酶辅助的分析方法大致可分为两类。一类是基于聚合酶辅助的循环扩增。端粒酶底物(TS)引物延伸后，引发探针能够与模板绑定，在聚合酶的作用下产生聚合反应。然而，由于非特异性探针可能能够作为引发探针，在聚合酶的高DNA复制活性下发生扩增反应，基于聚合酶的方法常产生非特异性背景。为了避免上述不足，另一类基于外切酶辅助的循环扩增受到了广泛关注。在TS引物延伸反应后，荧光探针能够被外切酶切割，使荧光团和猝灭团相互远离，带来增强的荧光信号。不幸的是，上述分析方法涉及DNA探针的标记，不仅由于空间位阻效应降低了探针绑定效率，也由于猝灭团对荧光团的不完全猝灭导致高背景。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于免标记分子信标的级联扩增DNA机器及应用，能够提高端粒酶活性检测的灵敏性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种免标记的分子信标组，包括免标记识别分子信标(RMB)和免标记信号分子信标(SMB)，

所述RMB由5’末端至3’末端依次包括RMB悬垂立足点区域、RMB第一茎部区域、RMB间隔链和RMB第二茎部区域，所述RMB第一茎部区域与所述RMB第二茎部区域完全互补形成RMB茎部链，使RMB悬垂立足点区域形成RMB的凸出的5’末端，所述RMB悬垂立足点区域和RMB第一茎部区域形成能够与端粒酶延伸产物(TEP)杂交的区域，部分RMB间隔链与部分RMB第二茎部区域形成引发DNA区域；

所述SMB由5’末端至3’末端依次包括SMB悬垂立足点区域、SMB第一茎部区域、RMB间隔链和SMB第二茎部区域，所述SMB第一茎部区域与所述SMB第二茎部区域完全互补形成SMB茎部链，使SMB悬垂立足点区域形成SMB的凸出的5’末端，所述SMB悬垂立足点区域和SMB第一茎部区域形成能够与引发DNA杂交的区域，部分SMB间隔链与部分SMB第二茎部区域形成G4序列。

本发明所述的TEP为利用端粒酶对其TS引物进行延伸反应的产物。

本发明所述的延伸反应为利用端粒酶的活性来延伸TS引物，在TS引物的3’端延伸产生多个TTAGGG重复序列的反应。