[发明专利]一种基于免标记分子信标的级联扩增DNA机器及应用

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断或治疗目的端粒酶活性检测的试剂盒，其特征是，包括TS引物、免标记的分子信标组、延伸反应溶液和级联扩增溶液；所述免标记的分子信标组，包括免标记识别分子信标RMB和免标记信号分子信标SMB，

所述RMB由5’末端至3’末端依次包括RMB悬垂立足点区域、RMB第一茎部区域、RMB间隔链和RMB第二茎部区域，所述RMB第一茎部区域与所述RMB第二茎部区域完全互补形成RMB茎部链，使RMB悬垂立足点区域形成RMB的凸出的5’末端，所述RMB悬垂立足点区域和RMB第一茎部区域形成能够与端粒酶延伸产物TEP杂交的区域，部分RMB间隔链与部分RMB第二茎部区域形成引发DNA区域；所述RMB的核苷酸序列为：RMB-10的核苷酸序列SEQ ID NO.4；所述TEP的核苷酸序列为：AAT CCG TCG AGC AGAG(TTAGGG)n，其中，下划线部分为TS引物序列，倾斜部分为引物延伸序列；

所述SMB由5’末端至3’末端依次包括SMB悬垂立足点区域、SMB第一茎部区域、SMB间隔链和SMB第二茎部区域，所述SMB第一茎部区域与所述SMB第二茎部区域完全互补形成SMB茎部链，使SMB悬垂立足点区域形成SMB的凸出的5’末端，所述SMB悬垂立足点区域和SMB第一茎部区域形成能够与引发DNA杂交的区域，部分SMB间隔链与部分SMB第二茎部区域形成G4序列；所述SMB的核苷酸序列为：SMB-1的核苷酸序列SEQ ID NO.8；

所述延伸反应溶液包括5×TRAP缓冲液、dNTPs和BSA；

所述级联扩增溶液包括T7 Exo和10×T7 Exo反应缓冲液。

2.一种如权利要求1所述的试剂盒在非疾病诊断或治疗目的端粒酶活性检测中的应用。

3.一种基于权利要求1所述的试剂盒的非疾病诊断或治疗目的检测端粒酶活性的方法，其特征是，包括以下步骤：细胞提取液中的端粒酶引发TS引物的延伸反应，获得TEP，再将TEP加入至含有免标记的分子信标组的级联扩增溶液中进行级联扩增反应，然后对扩增体系进行荧光检测获得荧光强度，以建立荧光强度与细胞提取液浓度之间的线性方程；通过所述步骤获得待测样品的荧光强度，最后将获得的待测样品的荧光强度代入所述线性方程，计算得到待测样品的细胞浓度。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是，将级联扩增反应后获得的混合体系与NMM混合后进行荧光检测。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是，其步骤如下：

(1)将不同浓度的细胞提取液分别与TS引物混合后，恒温孵育，使端粒酶延伸TS引物，分别获得不同细胞个数的TEP；

(2)将步骤(1)获得的不同浓度的细胞提取液反应产生的TEP分别加入至含有免标记的分子信标组的级联扩增溶液中，恒温孵育，使得TEP进行级联扩增反应；

(3)通过荧光检测，获得步骤(2)孵育后的不同的混合体系的荧光强度；

(4)通过步骤(3)获得的荧光强度建立荧光强度与细胞提取液浓度之间的线性方程；

(5)将待测样品的进行步骤(1)-(3)后获得的荧光强度代入至步骤(4)中的线性方程，计算得到待测样品的细胞浓度。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，步骤(2)中含有免标记的分子信标组的级联扩增溶液为：5μL浓度为1μM的RMB，5μL浓度为10μM的SMB，3μL浓度为10 U/μL的T7 Exo，4μL的10×T7 Exo反应缓冲液以及18μL的DEPC处理过的超纯水；

10×T7 Exo反应缓冲液为：20mM Tris-Ac，pH7.9，50mMKAc，10mM Mg(Ac)₂和1mM DTT；

RMB和SMB在制备含有免标记的分子信标组的级联扩增溶液之前需要在95℃下加热5min退火，所述在95℃下加热5min退火为：在95℃下保持5min，然后缓慢降至室温，降温过程至少1h。

7.如权利要求5所述的方法，其特征是，步骤(3)中，将步骤(2)获得的混合体系加入5μL浓度为25μM的NMM和5μL浓度为100mM的KCl，在37℃下共同孵育0.5h后，再进行荧光检测；步骤(3)中，所述荧光检测的参数为：λ_ex＝399nm，λ_em＝612nm，PMT检测器的电压为700V；步骤(4)中，建立的线性方程为：ΔF＝0.4707×C+38.87，

其中，ΔF＝F-F₀，F为待测样品的荧光强度，F₀为不含端粒酶提取液的样品的荧光强度，C为待测样品中的HeLa细胞浓度，单位：细胞/mL，R²＝0.993。