[发明专利]一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，包括：在无3’‑5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与胚系碱基突变位点野生型基因型一致而与突变型基因型不一致，在有胚系碱基突变位点野生型模板存在的情况下，DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，使用实时荧光定量PCR对样本进行检测，与内参基因的Ct值比较判断样本有无纯合突变或杂合突变。本发明的方法能够提高特异性和灵敏度，可针对胚系碱基突变，并可定量检测基因频率，解决了ASA‑PCR假阳性导致基因频率定量不准的问题。

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其涉及一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法。

背景技术

等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)利用的是碱基错配不能扩增的原理，设计特异的正向引物和远端反向引物，引物3’端与SNP的突变型基因型相同，因此只有突变型模板能被扩增，野生型模板无法扩增。

2000年，Liu和Sommer在AS-PCR基础上进行改进，将引物3’端脱氧核苷酸dNMP更换为双脱氧核苷酸ddNMP，使用无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，只有3’末端与模板互补的引物发生焦磷酸解才能进行扩增，不互补的引物则无法扩增。这种扩增依赖焦磷酸解反应的激活，称为焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis-activated polymerization，简称PAP)。与传统的AS-PCR相比，这一改进显著增加了扩增的选择性和特异性。

2006年，Liu和Sommer使用的聚合酶是在F667Y突变基础上将N端删除的Taq DNA聚合酶，这种酶被切除了5’-3’核酸外切酶结构，扩增产物突变错配率是Taq DNA聚合酶的1/2，能够准确地对引物3’端进行焦磷酸解反应。

目前碱基胚系突变检测的常用方法包括测序和实时荧光定量PCR等，实时荧光定量PCR采用△△CT值法，设计与碱基突变野生型基因型一致的引物特异性扩增野生型模板，利用野生型模板和内参基因作为对照，样本拷贝数与内参基因拷贝数的比值，与野生型基因拷贝数与其内参基因拷贝数的比值比较得出基因频率，理论上，纯合野生型基因该比值为100％，杂合突变比值为50％，纯合突变该比值为0％。但是由于该方法所使用的酶具有矫正功能，因此一部分突变型模板也会扩增，导致检测到的基因频率偏高。

现有技术存在如下缺点：(1)假阳性，由于引物3’端不严格配对，因此PCR中引物3’末端与突变位点不匹配也可以发生非特异性扩增，导致假阳性，进而导致检测到的基因频率偏差大，准确率低；(2)二级结构，多对引物存在同一反应体系中易形成二级结构，尤其是引物3’端连续4bp有反向互补序列容易形成引物二聚体；(3)异质性，针对恶性肿瘤体细胞突变的检测样本DNA多采集自肿瘤组织，存在取样位置不同产生的异质性问题。

发明内容

本发明能够提高实时荧光定量PCR检测胚系突变基因频率的准确性，减少误差，适合用于遗传性肿瘤纯合或杂合突变的检测，为胚系碱基突变定量检测提供一种特异性较高的新方法。

因此，本发明提供一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，包括：在无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，上述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与胚系碱基突变位点野生型基因型一致而与突变型基因型不一致，在有胚系碱基突变位点野生型模板存在的情况下，上述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解上述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，野生型模板被扩增，使用实时荧光定量PCR对样本进行检测，与内参基因的Ct值比较判断样本有无纯合突变或杂合突变。