[发明专利]环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA甲基转移酶活性

权利要求书

1.一种非疾病诊断和治疗目的的检测DNA甲基转移酶活性的方法，其特征是，具体包括以下：

a、当待测样品中存在DNA甲基转移酶时，所述DNA甲基转移酶特异性识别和催化长茎环探针发生甲基化，形成具有甲基化的长茎环；所述长茎环探针的序列为SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示；

b、甲基化敏感型限制性内切酶将甲基化的长茎环切割成两部分，一部分为双链DNA，另一部分为新发夹探针，所述新发夹探针结构不稳定，发生构象转变成单链DNA形成触发链；

c、所述触发链与链置换模板发夹探针杂交，并在链置换扩增活性的聚合酶和切割酶的作用下引发聚合和切割反应，释放出多个引物；

d、在DNA连接酶的作用下所释放的引物与挂锁探针杂交得到环状探针；所述挂锁探针序列如SEQ ID NO:13所示；

e、所释放的引物在滚环扩增活性的聚合酶作用下触发滚环扩增，合成含多个串联的富含G序列的长DNA产物；

f、切割酶切割所述长DNA产物和挂锁探针杂交所形成的双链DNA，产生富含G的序列和所述引物，所述引物继续用于引发下级滚环扩增；

g、在金属离子的作用下，富含G的序列折叠成G-四倍体结构，其选择性与染料作用得到增强的荧光信号，即测得DNA甲基转移酶的活性；

所述方法为非疾病诊断与治疗方法。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤b中，所述甲基化敏感型限制性内切酶为各种类型DNA甲基转移酶所对应的限制性内切酶；

步骤c中，所述发夹探针包括茎环序列和连接在其茎部序列上的悬垂单链；其中，所述茎环序列中包括释放滚环扩增时的引物的互补序列和切割酶特异性识别序列，所述悬垂单链与触发链互补；

所述链置换扩增活性的聚合酶为Klenow Fragment聚合酶；

所述切割酶为Nt.BbvCI酶；

所释放出的引物序列能够特异性滚环扩增出所述挂锁探针互补序列富含G的序列；

步骤d中，所述DNA连接酶为T4连接酶；

所述挂锁探针包括若干个富含C序列，相邻的富含C序列之间为切割酶的特性识别位点序列，

步骤e中，所述滚环扩增活性的聚合酶为Phi29 DNA聚合酶；

步骤f中，所述切割酶为Nt.BbvCI酶；

步骤g中，所述金属离子为K⁺，所述染料为N-甲基卟啉二丙酸IX。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是，具体包括以下操作步骤：

（1）向待测样品中加入长茎环探针和甲基化敏感型限制性内切酶进行孵育；

（2）向步骤（1）反应得到的体系中加入发夹探针、链置换扩增活性的聚合酶、切割酶和扩增原料dNTPs进行孵育，发生链置换反应，释放用于后续扩增的引物；然后进行酶失活；

（3）向步骤（2）反应得到的体系加入DNA连接酶和挂锁探针进行孵育，所释放的引物与挂锁探针杂交得到环状探针；

（4）向步骤（3）反应得到的体系中加入滚环扩增活性的聚合酶、切割酶和扩增原料dNTPs进行孵育，发生滚环扩增反应；

（5）向步骤（4）反应得到的体系中加入金属离子和染料进行孵育，然后检测荧光信号。

4. 一种进行DNA甲基化转移酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征是：加入候选抑制剂/拮抗剂和所述长茎环探针，进行孵育，然后加入DNA 甲基化转移酶；后续步骤如权利要求1的步骤b~g。