[发明专利]西红花及西红花内生真菌GGPPS基因、基因克隆方法与应用

权利要求书

1.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其特征在于，其是为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的基因。

2.根据权利要求1所述的一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其特征在于，该基因的cDNA全长序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.一种西红花内生真菌，其特征在于，生物学名称为Cadophora luteo-olivacea.，其指定名称为3P1CQ1，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.11606，保藏日期为：2015年11月24日。

4.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因编码的蛋白质，其特征在于，其是为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列构成的蛋白质。

5.一种西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其特征在于，其cDNA开放阅读框序列为如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

6.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据CTAB法提取西红花内生真菌菌丝体基因组DNA，然后在NCBI GenBank中搜索同源属中已报道的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因序列，根据同源性设计引物Fg1：5'-AAATCAGTTCTGCGACCTGTTCC-3'和Rg1：5'-CGGTCTTGTTTCCAACCATTTC-3'，经PCR扩增得到584bp的GGPPS基因保守片段；

2)根据该584bp基因序列设计3′端和5′端RACE特异引物GSP1：5'–ATCGCCTTGGGGTTCTTCAGC–3'、GSP2：5'–CGACCTGTTC CAGAGGGCGATTG–3'、GSP3：5'–GCCAGTCTGAATAACCCTCCTGTCTT–3'；

3)运用RACE技术的同源性克隆方法，克隆出GGPPS基因3′端和5′端cDNA基因序列，经序列拼接得到cDNA的全长序列，如SEQ ID No.1所示；

4)设计ORF酶切引物fGGPPS：5'-GAAGATCTATGTTCCACAGCAACCGCTCAGCAC-3'和rGGPPS：5'-ATAAGAATGCGGC CGCTCA AACAGCCATCTTATCC-3'，克隆牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的cDNA和DNA序列，如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示；

5)生物信息学分析GGPPS基因序列及其编码的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示，初步鉴定该基因。

7.一种西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取西红花柱头基因组DNA和RNA，用西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的ORF引物fGGPPS：5'-GAAGATCTATGTTCCACAGCAACCGCTCAGCAC-3'和rGGPPS：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCA AACAGCCATCTTATCC-3'，克隆西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因；

2)以西红花柱头的基因组DNA为模板进行PCR，克隆得到西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶DNA序列，如SEQ ID No.4所示；

3)用西红花柱头RNA进行反转录合成西红花柱头的RACE-ready cDNA，以西红花柱头的cDNA为模板进行PCR，克隆得到GGPPS的cDNA序列，如SEQ ID No.4所示。

8.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的应用，其特征在于，西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因在细菌、真菌、藻类和高等植物中通过基因工程的手段参与合成萜类化合物，所述的萜类化合物包括类胡萝卜素、赤霉素或维生素E；

所述西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其是为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的基因。

9.一种西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的应用，其特征在于，西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因在细菌、真菌、藻类和高等植物中通过基因工程的手段参与合成萜类化合物，所述的萜类化合物包括类胡萝卜素、赤霉素或维生素E；

所述西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其cDNA开放阅读框序列为如SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列。