[发明专利]一种利用酵母菌表达含有穿膜肽的寡肽‑1（EGF）创新制备工艺

说明书

发明领域

本发明涉及一种工业化生产含有穿膜肽的寡肽-1(EGF)的制备方法，属生物工程领域。

发明背景

穿膜肽是由小于30个氨基酸组成的具有细胞穿透功能的小肽，它能通过与细胞膜的相互交联作用而穿过细胞膜这一天然屏障。最近通过设计获得的ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽，能够引导所承载的寡肽-1修复蛋白穿透细胞膜，经表皮渗透吸收，富含碱性氨基酸，含有较多的正电荷的肽片段，靶向导入皮肤基底层受体。该穿膜肽具有以下特性：

①具有净正电荷性和两亲性；②穿膜转运效率高；③可以导入近乎所有的细胞；④可以携带多种活性物质进入细胞；⑤可靶向穿透细胞膜，达到灭活多种病毒且不造成细胞损伤。

寡肽-1(EGF)是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活细胞，藉由刺激寡肽-1受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，对创伤、溃疡等受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖逆分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。最初的寡肽-1主要被运用于医学领域，以促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤、溃疡、促进伤口愈合、修复肠胃道、肝脏和眼角膜的损伤等，功效十分显著。现代临床早已将寡肽-1扩大应用于医疗耗材、人体保健及抗衰老的化妆品领域。

寡肽-1(即：重组人表皮生长因子)是美国生化学家Stanley Cohen博士于1962年最先在小鼠下颌腺的提取液中发现，并提出该因子有直接促进皮肤粘膜的修复和表皮细胞的生长，并能使衰老的细胞逆分化为年轻细胞，有促进胶原蛋白和弹力蛋白的合成，能促进肉芽组织再生，延缓细胞衰老、滋养女性生殖器官、淡化皱纹与色斑的作用，它是人类医学与美学史上最伟大的发现之一。Stanley Cohen博士发现的EGF生长因子于1986年获国际诺贝尔生理医学奖。寡肽-1(EGF)全球市场需求量大，产品资源十分稀缺，为了解决全球市场对寡肽-1EGF敷料的需求供给，我公司联合美国哈佛大学魏博士、山东农业大学于博士、中华生物医药研究院、广东医保药业有限公司共同研究，创新了一种用酵母菌表达含穿膜肽的寡肽-1EGF制备方法，制得高纯度融合新蛋白(PHPV蛋白)。用酵母菌表达含有穿膜肽与寡肽-1融合新蛋白(即PHPV蛋白)，PHPV蛋白不仅有穿膜肽与寡肽的独立功能，而且其交联融合后的新蛋白表面的负电荷(阴离子)C端与人乳头瘤病毒HPV颗粒上的N端正电荷(阳离子)相互络合，通过其表面所带正电荷的N端与中间的疏水区及含有肽酶的识别区位点的C端负电荷相结合，将膜转位信号与核定位信号的NLS偶联，从而阴断人乳头瘤病毒侵入宿主细胞内，再通过细胞膜的相互作用而穿透细胞膜这一天然屏障，达到破坏病毒胞膜外壳治疗HPV 感染的目的。

目前世界上尚未有含穿膜肽的寡肽-1融合蛋白在酵母菌中的基因工程工业化生产方法。

发明内容

本发明涉及穿膜肽和寡肽-1的融合蛋白，穿膜肽是通过设计获得的ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽，(理论基础＝WENDE PA，ROTHBARD J B，JESSOP T C，et al.Oligocarbamate molecular transporters：Design，synthes is，and biological evaluation of a new class of transporters for drug delivery JAme Chem Soc，2002，124(45)：13382-13383)富含碱性氨基酸，ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽位于寡肽-1(EGF)的C-端，优选紧邻寡肽-1，也可以通过间隔序列与寡肽-1相连，含有较多的正电荷的肽片段，利用正负电荷非特异性相互作用的原理与细胞膜结合，打开皮肤细胞膜从而将目的蛋白靶向导入皮肤基底层受体。

本发明的目的是解决工业用基因工程酵母菌生产含穿膜肽的寡肽-1(EGF)的融合蛋白的方法。

一种工业化生产含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合蛋白的制备方法，生产步骤如下：

(1)酵母菌扩培发酵：