[发明专利]一种用纤维素载体固定β-葡萄糖苷酶的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶的技术领域，具体涉及一种固定β-葡萄糖苷酶的方法及应 用。

背景技术

研究发现，在人体内，醣苷型的异黄酮不能直接被吸收，而是经小肠中细菌产生的 β-葡萄糖苷酶水解去醣基后进入血液，才能发挥各种生理作用(Izumietal.,2000; Takahashietal.,2005)。而人体小肠中的菌群由于个体差异会有很大差异，所以如果直 接摄入不带醣基的苷元型异黄酮，则可以有效提高其利用效率(Tsangalis,Ashton, Stojanovska,Wilcox,&Shah,2004)。微生物生产的β-葡萄糖苷酶是目前主要应用于大 豆异黄酮去醣基的酶，然而酶成本较高，反应过程中易失活，且不能被回收利用，因此应用 上有其局限性。所以，若将酶固定到化学性质稳定的不溶性载体上，则可以有效解决上述问 题(Dervakos&Webb,1991)。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术中存在的问题，提供一种用纤维素载体固定β- 葡萄糖苷酶的方法，用于黑豆浆中大豆异黄酮醣去醣基作用，以期建立可用于稳定、高效生 产具有高生理活性黑豆浆的反应系统。

所述用纤维素载体固定β-葡萄糖苷酶的方法，包括以下步骤：

（a）纤维素载体的合成与修饰：

①取6.25g市售纤维素粉末溶于50ml丙酮与DMSO组成的有机溶剂中，所述丙酮与DMSO 的体积比为3:2，将所得溶液用针筒逐滴滴入冷水中，形成纤维素颗粒并将其置于室温下干 燥待用；

②量取体积大约为40cm³所述纤维素颗粒置于100ml浓度为0.2mol/L的NaOH溶液中，在 40℃条件下加热90min，以增加其表面之羟基数目。

（b）纤维素载体与酶的共价结合：

③将经上述步骤加热处理过的40cm³纤维素载体置于50ml加热至100℃的3%（v/v）的 戊二醛水溶液中1h后，在室温下用蒸馏水冲洗；

④将β-葡萄糖苷酶溶于浓度为0.1mol/L、pH6的磷酸缓冲液中形成浓度为1mg/ml的酶 溶液，并与所述经步骤③处理的纤维素载体在4℃条件下混合静置16h；

⑤用纱布将酶溶液滤去并保留滤液待测，用0.1mol/L、pH6的磷酸缓冲液冲洗纤维素载 体，在4℃条件下储存，得到所述固定化酶。

所述固定化酶含量测定：

①将1mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液序列稀释，分别加入10μl与200μl浓度为10%的染色 剂Coomassieblue，30min后测定其在595nm的吸光值，绘制标准曲线。

②在制备固定化酶所得的滤液中加入10μl浓度为10%的染色剂Coomassieblue， 30min后测定其在595nm的吸光值，根据标准曲线方程得出滤液中残留的蛋白含量，从而得 到固定于载体上的酶含量。

所述固定化酶最适作用温度及酶活动力学测定：

在pH为6的磷酸缓冲液中加入5mgp-NPG，依次以所述固定化酶在30、40、50、60和70℃， 100rpm条件下反应1h。取反应后的底物900μl加入到1ml浓度为1MNa₂CO₃溶液中，在 425nm条件下测定其OD值。

配置浓度为0.1-20mmol/L的p-NPG溶液作为底物，分别用固定化酵素在其最适反 应温度下作用5min后，取900μl加入到1ml浓度为1M的NaCO₃溶液中，在425nm条件下测定其 OD值并根据标准曲线算出产物浓度，根据公式V=Vmax[S]/(Km+[S])得到酵素动力学常数Km 值，并与游离酶的结果做比较。

本发明以纤维素为载体固定化酶，应用于我国传统具有高营养价值的黑豆浆中的 异黄酮的去醣基化，形成具有高生理活性的游离态的苷元。利用固定化酶技术在黑豆浆的 加工过程中实现酶的重复利用以及方便产物的分离，在生产应用中具有极高的经济效应； 同时，将大多数农业废弃物的主要成分纤维素开发成为固定化酶的载体亦符合当今环境发 展的需求。

附图说明