[发明专利]三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒及其操作方法

说明书

本发明公开了三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒及其操作方法。本发明试剂盒包括：PBS预处理液、RNA快速提取液和检测液。本发明采用了快速提取RNA的方法，加上预混检测液、试剂一次性使用等设计，通过简化的三步操作即可完成病毒检测，检测过程不易被污染，可操作性强。本发明设计的试剂盒检测结果可视化，适用于无专业知识的基层工作人员，可用于防控石斑鱼诺达病毒的流行，应用前景广泛，适合商业化生产。

技术领域

本发明属于病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒及其操作方法。

背景技术

石斑鱼(Grouper)隶属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)，是我国南方沿海各省及东南亚各国最重要的海水养殖鱼类之一，其肉质鲜美、营养价值高，经济价值较大。石斑鱼黑身病是限制石斑鱼养殖业可持续发展的最重要病害之一，发病后最高死亡率可达100％，给该产业造成了巨大的损失。

β诺达病毒(Betanodavirus)是世界范围内的一种鱼类流行性传染病，已在欧洲海鲈(Lateolabrax japonicus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、黄带拟鲹(Pseudocaranxdentex)等40多种海水鱼类中报道出现了该病毒疫情，给包括石斑鱼(Grouper，Epinephelinae)在内的多种海水鱼类养殖业带来了巨大的损失。β诺达病毒也被称为神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，是引起石斑鱼病毒性神经坏死病(Viralnervous necrosis，VNN)或病毒性脑及视网膜病(Viral encephalopathy andretinopathy，VER)的病原，能够导致石斑鱼稚、幼苗大规模急性死亡。

加强病毒检疫、提前阻断病毒传播，是防控病毒类疾病的重要方法。随着生物技术的发展，已经发展出了多种能够提前检测病毒的方法，如细胞培养、荧光抗体、免疫组织化学、PCR等技术。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal Amplification，LAMP)是一种新型的PCR技术，通过设计4条特异、高效的引物，能够在等温条件下不间断地快速扩增目的序列，具有快速、灵敏、特异性高的优点。

但是，现行的LAMP试剂盒及检测方法具有组份复杂、操作繁琐、对检测人员技术要求高等不利因素，极大地限制了LAMP试剂盒的应用。特别是RNA病毒的检测，需要经过RNA提取、反转录、LAMP反应等多个环节。现行的RNA提取方法就需要经历Trizol抽提、氯仿分层、异丙醇抽提离心、100％乙醇、75％乙醇、DEPC水溶解RNA等多个步骤，再加上反转录、LAMP反应引物、酶、反应缓冲液添加等各种步骤，反应试管需要多次开盖添加试剂，导致多数的基层技术人员无法完成，即使完成，LAMP反应也极易被污染出现假阳性结果。

因此，开发出一种操作步骤少、简单有效、无污染的石斑鱼β诺达病毒快速检测技术具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无需特殊设备、快速有效、能够应用于养殖现场的三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒(Betanodavirus)的试剂盒及其操作方法。

本发明的三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：PBS预处理液、RNA快速提取液和检测液。

优选，所述的检测液含有AMV逆转录酶、RNase抑制剂、核酸荧光染料、环介导等温扩增试剂和β诺达病毒的检测引物组。