[发明专利]三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒及其操作方法

权利要求书

1.一种三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：PBS预处理液、RNA快速提取液和检测液；

所述的PBS预处理液是pH7.2±0.2的PBS溶液；

所述的RNA快速提取液是Epicentre Biotechnologies公司QuickExtract^TM RNAExtraction Solution型号的试剂；

所述的检测液为环介导等温扩增反应液，其每20μl体系中含有：8-10U/μl Bst 2.0聚合酶1μl，1-2U/μl AMV逆转录酶1μl，15-20U/μl RNase抑制剂1μl，1.0-2.0mM dNTPs 3.5μl，10×Amplification Buffer 2.5μl，6-8mM MgSO₄ 1.5μl，1M甜菜碱5μl，10×SYTO-9染料0.5μl，0.2μM上游外引物F₃ 1μl，0.2μM下游外引物B₃ 1μl，1.6μM上游内引物FIP 1μl，1.6μM下游内引物BIP 1μl；其中，10×Amplification Buffer含有200mM Tris-HCl、100mM(NH₄)₂SO₄、500mM KCl、20mM MgSO₄和1％Tween 20，PH 8.8；

上游外引物F₃为：5’-GGTGCAGTCGTTGCCAAAT-3’，

下游外引物B₃为：5’-CGACATAGCACCGACACG-3’，

上游内引物FIP为：5’-TCCTTTCCCGACGAGGTCCAGGTGGGAAAGCAGTACAGTCC-3’，

下游内引物BIP为：5’-AGCGTCTCACGTCACCTGGTACCACATCGGTGTTGTTGC-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测液所包含的组份已提前混合；所述的RNA快速提取液是直接分装而成的；所述的PBS预处理液、RNA快速提取液及检测液都为可直接使用的工作液。

3.一种非疾病的诊断和治疗目的的三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒的操作方法，其特征在于，其是利用权利要求1所述的试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：第一步，样品预处理：将样品于PBS预处理液中处理，制备成10³-10⁶个/mL的细胞悬浮液；第二步，RNA快速提取：再将细胞悬浮液加入到RNA快速提取液中进行病毒RNA提取得到总RNA溶液；第三步，病毒检测：然后将总RNA溶液加入到检测液中，置于63-68℃的水浴下保温1-1.5h；若检测液颜色发生改变，则说明样品中含有β诺达病毒；若检测液颜色未发生改变，则说明样品中不含有β诺达病毒。

4.根据权利要求3所述的操作方法，其特征在于，所述的将细胞悬浮液加入到RNA快速提取液中是取8～15微升的10³-10⁶个/mL的细胞悬浮液加入到100-200μl的RNA快速提取液中，并充分振荡1-3min，制成总RNA溶液；所述的将总RNA溶液加入到检测液中是吸取2-6微升总RNA溶液加入20μl的检测液中。