[发明专利]基于自动设计的引物的高效荧光等位基因特异性聚合酶链式反应方法及检测基因分型方法

说明书

本发明涉及一种等位基因特异性聚合酶链式反应的自动引物设计方法，还提供了采用上述设计的引物进行高效荧光等位基因特异性聚合酶链式扩展反应的方法及检测基因分型的方法；对于任意SNP位点，取得其上下游40～60bp的序列设计四个内引物，任意一个内引物的设计从3＇末端开始，任意一个内引物的3＇末端都在单核苷酸多样性位点上有特异性匹配，所述的单核苷酸多样性位点的匹配位点在引物3＇末端的－1～－3位；得到内引物后，在每个内引物5’端加一个不与模板特异性匹配的短片段，内引物与短片段共同组成外引物。通过本发明可以在相同的反应条件下实现高的基因分型分析的检测特异性。

技术领域

本发明涉及生物基因领域，尤其涉及一种等位基因特异性聚合酶链式反应(AS－PCR)反应，具体来说是基于自动设计的引物的高效荧光等位基因特异性聚合酶链式反应方法及检测基因分型方法。

背景技术

随着对人类基因组的深入研究，基因检测越来越显示出重要的作用。近年来绝大部分的检测都是针对单核苷酸多样性(SNP)。因为它是基因组中最普遍存在(占95％以上)、形式最简单(一个碱基变化到另一个碱基)、研究最明确(数百万个SNP位点的位置、频率都很明确，它们跟疾病的关系等都有大量的研究)。对SNP的分型分析不但在科研上有广泛的需求，而且随着基于全基因组SNP的关联研究的大量开展，上万个SNP位点显示出与各种疾病、健康、个性特征的明确关系。用基因检测来进行精准医疗和精准健康管理已经成为一条明确的新型产业道路。

因此，对SNP进行检测的技术非常关键。其中基于固态芯片的高通量基因分型分析技术已经相当成熟，然而固态芯片其单片基本成本高，位点设固定不可调整，而且开发时间长，不适合于现在市场要求的快速灵活的中小通量(通量是指一次可以检测的位点数)检测体系。现有的中低通量技术以Tagman、SNaPshot和MassARRAY为代表，但这些技术严重依赖大型精密仪器和进口试剂，且实验步骤繁复，工作量大，周期长。特别是引物这一项。大部分现有技术需要经过特殊处理或荧光基团标记的引物。由于每个位点的引物是专属不可通用的，这些修饰步骤造成检测成本和开发费用高昂。

等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)技术很早就出现，具有灵活性大，步骤简单，仪器依赖性低，适于模块化生产等重要优点。然而现有的AS-PCR技术有灵敏性低、位点设计失败率高等缺点。特别是不同的位点设计出来的适配引物其最佳反应条件往往差别很大，很难在统一的仪器和反应条件下进行检测，所以基于AS-PCR技术的基因检测一直没有成功的标准化与工业化。

等位基因特异性PCR的基本原理是，根据SNP位点设计特异引物。传统方法是其中一条链(特异链)的3′末端与SNP位点的碱基特异性匹配，另一条链(普通链)按常规方法进行设计。一般SNP有两个不同的等位基因，比如A/G，则设计的第一套引物是可以跟A型特异性匹配的，第二套跟G特异性匹配。在理想的PCR反应条件下，如果样本DNA模板中该位点的基因型为AA，则A的特异性引物构建的PCR反应会产生链式扩增，生产出大量的DNA双链产物；而对G特异性的引物由于与DNA模板之间存在序列错配，则不能发生正常的PCR反应，不会产生大量的扩增产物。传统的AS-PCR完成后一般通过跑凝胶电泳来检查是否有预期的DNA产物，如果在既定的产物分子量上发现了DNA条带，则该特异性引物标记的等位基因为阳性，否则为阴性。但是传统AS-PCR存在以下一些缺点：

1)引物特异性不高。以传统方案设计的引物，即使跟模板DNA有不匹配，也很可能发生非特异性扩增反应，从而产生假阳性。

2)反应体系敏感，稳定性不高。AS-PCR的阳性检测判断是基于能够在引物与模板匹配时成功进行PCR扩增。然而传统的PCR反应受很多因素的影响，包括样本质量和试剂老化程度等等。由于普通PCR引物和反应条件受这些因素影响较大，因此容易造成假阴性的结果。

3)不同SNP的AS-PCR的条件差异大。传统AS-PCR的最大问题是不同位点设计出来的检测反应，其最优反应条件往往差异很大。这造成实验要针对每个SNP位点进行专门的实验条件优化，不利于大规模的量化检测。