[发明专利]基于自动设计的引物的高效荧光等位基因特异性聚合酶链式反应方法及检测基因分型方法

权利要求书

1.一种等位基因特异性聚合酶链式反应的自动引物设计方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)对于任意SNP位点，取得其上下游40～60bp的序列设计四个内引物，任意一个内引物的设计从3＇末端开始，任意一个内引物的3＇末端都在单核苷酸多样性位点上有特异性匹配，所述单核苷酸多样性位点的匹配位点在任意一个内引物3＇末端的－1～－3位，四个内引物的退火温度在44－60℃之间；

(2)得到内引物后，在每个内引物5’端加一个不与模板特异性匹配的短片段，所述短片段的长度在2～10bp，内引物与短片段共同组成外引物，所述的四个外引物的退火温度在55～75℃之间。

2.根据权利要求1所述的一种等位基因特异性聚合酶链式反应的自动引物设计方法，其特征在于：所述四个内引物的退火温度优选为51℃。

3.根据权利要求1所述的一种等位基因特异性聚合酶链式反应的自动引物设计方法，其特征在于：所述的每个内引物所加的短片段的长度和序列不同。

4.根据权利要求1所述的一种等位基因特异性聚合酶链式反应的自动引物设计方法，其特征在于：所述的四个外引物的退火温度优选为59℃。

5.根据权利要求1所述的一种等位基因特异性聚合酶链式反应的自动引物设计方法，其特征在于：所述的四个外引物的5’末端不与任意一个内引物的3’末端发生任意连续3个bp以上的匹配。

6.一种采用如权利要求1所述设计引物的高效荧光等位基因特异性聚合酶链式扩展反应，其特征在于：采用引物进行二步法扩增，反应条件为：85～98℃，3min；85～98℃，10～40s；55～75℃，2～40s；执行30～60个循环后4℃保存。

7.一种基于如权利要求6所述链式扩展反应的采用实时荧光检测SNP位点基因分型的方法，其特征在于：在链式扩展反应体系中，将水替换成用于实时荧光PCR的荧光染料，对两个等位基因分别做一个实时PCR反应，进行30个以上的PCR循环，在每个PCR循环的低温时段检测体系中的荧光值，其荧光信号的强弱以线性或非线性地反映体系内的双链DNA总量，从实时曲线中读取该SNP的基因型。

8.一种基于如权利要求6所述链式扩展反应的采用终点法荧光检测SNP位点基因分型的方法，其特征在于：在链式扩展反应完成后，加荧光试剂进行终点读值法，检测荧光强度来判断SNP的基因型。

9.根据权利要求1所述的一种等位基因特异性聚合酶链式反应的自动引物设计方法，其特征在于：所述的每个内引物所加的短片段的长度和序列相同。