[发明专利]一种高含量西索霉素发酵液的制备方法在审
| 申请号： | 201610155486.5 | 申请日： | 2016-03-18 |
| 公开（公告）号： | CN105603026A | 公开（公告）日： | 2016-05-25 |
| 发明（设计）人： | 汪巍;宋国 | 申请（专利权）人： | 常州市蓝勖化工有限公司 |
| 主分类号： | C12P19/48 | 分类号： | C12P19/48;C12R1/385 |
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| 地址： | 213155 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 含量 霉素 发酵 制备 方法 | ||
技术领域
本发明公开了一种高含量西索霉素发酵液的制备方法，属于药物合成领域。
背景技术
氨基糖苷类抗生素是继青霉素之后发现较早的一类抗生素。西索米星(sisomicin，简称SISO)是小单孢菌生物合成的一种氨基糖苷类抗生素，不但能直接用于生产西索米星针剂，而且是半合成抗生素奈替米星(Netilmicin)的原料。西索米星和奈替米星均列入中国国家基本药物名录，对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌有很强的抗菌作用。
现有生产西索霉素发酵液的方法是以玉米淀粉、黄豆饼粉等为原材料，在微生物伊尼奥小单孢放线菌的作用下，多采用三级发酵，在发酵过程中进行适时补料生产西索霉素发酵液，利用薄层层析生物显影测定西索霉素效价，西索霉素的生物效价一般在700～1200ug∕mL，西索霉素主组份在70～80％，提取纯化收率只能达到50～60％。
现有生产西索霉素发酵液的方法，其不足之处在于：西索霉素生产过程中发酵液生物效价较低，高低悬殊较大，生产不稳定，西索霉素的主组份不高，提取纯化收率低。
发明内容
本发明主要解决的技术问题：针对目前西索霉素发酵液生物效价较低，高低悬殊较大，生产不稳定，西索霉素的主组份不高，提取纯化收率低的问题，本发明首先通过伊尼奥小单孢菌进行活化，再将活化后的菌种在甲磺酸乙酯及微波状态下诱导变异，再将变异菌种放入发酵罐中，在氯化钴溶液催进西索霉素的产生，同时在针对菌液的引发下，产生西索霉素，再通过过滤分离，从而制备得高含量西索霉素发酵液，纯化收率高。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）按重量百份比计，取30～35份蔗糖、22～25份琼脂、13～15份质量分数为10％的硝酸钾溶液、10～12份质量分数为12％的氯化钠溶液及18～20份葡萄糖，搅拌均匀后使用质量分数为5％的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，在120～130℃下，消毒杀菌30～40min，得斜面培养基；
（2）使用接种环将伊尼奥小单孢菌接种至上述斜面培养基，接种1～3次，将接种后的斜面培养基置于32～35℃，无菌环境下，培养7～9天后，将培养基移至0～4℃的冰箱中储存4～6天，得斜面培养后的菌种，备用；
（3）按重量份数计，取35～42份淀粉、15～18粉豆腐渣、30～32份牛肉膏、3～4份L-脯氨酸、8～10份质量分数为10％的硫酸镁溶液、0.6～1.2份磷酸氢二钾及0.4～0.8份磷酸二氢钾，搅拌均匀后使用质量分数为5％的氢氧化钠溶液调节pH至7.5，在110～120℃下，消毒杀菌30～40min，得种子培养基；
（4）按照种子培养基体积8～12％的接种量，将步骤（2）中备用的斜面培养后的菌种接种至种子培养基上，随后将种子培养基移至摇床培养箱中，在30～35℃，190～220r/min下，培养50～60h，在培养过程中，每8～10h向其中加入种子培养基体积0.8～1.4％的甲磺酸乙酯；
（5）待上述培养结束后将种子培养基取出，放置于微波振荡器中，在500～800MHz下振荡2～3h，再将振荡后的种子培养基按照15～18％的接种量，放入发酵瓶中，分别向其中加入种子培养基质量4～6％的麦芽糖、种子培养基质量1～3％的质量分数为10％的氯化钴溶液，搅拌均匀，温度设定为30～35℃，转速设定为160～190r/min，通气量1:1.3～1.9，发酵5～7天，在发酵过程中每5～7h，向其中加入氯化钴溶液等体积的1.3×105CFU/mL的铜绿假单胞菌菌液；
（6）待上述发酵结束后收集发酵液进行过滤，收集过滤液，将所得的过滤液放入离心机中，在9000～10000r/min下离心分离5～8min后，收集上清液，在紫外灯下杀菌，即可得到高含量西索霉素发酵液。
经检测本发明所得的高含量西索霉素发酵液得：西索霉素的生物效价为1200～2050ug∕mL，西索霉素主组份为90～94.2％，提取纯化收率达到76.5～83.8％，对环境无污染。
本发明的有益效果：
（1）本发明所得的高含量西索霉素发酵液纯化收率高，且生物效价高；
（2）本发明所得的高含量西索霉素发酵液成本低，易于操作。
具体实施方式
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