[发明专利]一种质粒载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种质粒载体及其构建方法和应用，所述质粒载体由pCAMBIA1300改造构建形成，在pCAMBIA1300多克隆位点插入葡萄座腔菌组蛋白H3基因启动子、葡萄座腔菌转录延长因子α基因启动子、抗性基因，所述抗性基因位于葡萄座腔菌转录延长因子α基因启动子的下游。本发明选择的葡萄座腔菌组蛋白H3基因和转录延长因子α基因启动子的区段，能够高效启动连接在后面的基因，因此大大提高该质粒载体的转化效率；本发明建立了利用农杆菌介导的外源基因高效转化葡萄座腔菌的方法，为该菌的遗传改造、开发有用基因、分离病原真菌的药物靶点基因、研究该菌的基因功能等方面的研究开发提供可行性方案。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种质粒载体及其构建方法和应用。

背景技术

葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是一种常见的全球分布的重要真菌，具有重要的开发利用价值。这类真菌有的可以腐生在各种腐木上，有的在多种木本植物上寄生，引起木本植物的病害，有的与植物形成共生体，是许多植物的内生真菌。在腐木上营腐生生活的葡萄座腔菌可以将木本植物残体分解，在生态系统的物质循环和能量循环中具有重要作用；同时，这类真菌还可以被开发以生产木质素酶和纤维素酶，具有很好的经济开发前景。而属于内生真菌的菌株可以作为生物反应器，如从北非雪松中分离的一株真菌可以产生15种新的化合物，其中有3种具有抗病原真菌、抗氧化功能。

作为植物病原菌的葡萄座腔菌菌株也有开发价值，是重要的待开发生物资源。植物病原菌要成功侵染寄主植物，就必须能够克服植物的防卫反应，还要能够穿过植物表皮等植物的物理保护屏障。因此，植物病原菌往往能够产生比腐生菌更多的胞外降解酶和其他效应子，使植物的防卫反应下降，并将植物表皮细胞壁成分进行必要的降解。

一些真菌的基因组序列分析结果也表明，与腐生真菌相比，植物病原真菌的基因组中含有更多的细胞壁降解酶基因，而内生真菌的基因组中含有的细胞壁降解酶基因最少。因此，植物病原菌可以开发成生产胞壁降解酶类的生物资源，如降解作物秸秆或林木残体，在环境保护、生物质能源开发方面具有很好的应用前景。作为植物病原菌的葡萄座腔菌菌株还可以用于生物转化生产特定的功能化合物，如诺卡酮(Nootkatone)是重要的工业原料，葡萄座腔菌可以将巴伦西亚橘烯转化为诺卡酮Nootkatone，在减肥产品、增强免疫力的保健产品和美容产品。

随着现代生物技术的发展，分子生物学技术已经与传统生物学技术结合在一起，大大促进了生物学研究和生物产业的发展，无论是对生物细胞的分子改造，还是克隆有用的基因，都需要建立外源基因转化进入细胞的转化体系，这是对细胞进行分子改造和研究的前提。针对葡萄座腔菌这种具有重要经济意义的真菌，截止目前，该菌的基因转化效率比较低。

例如，质粒pKO1-HPH是丝状真菌基因转化中常用的载体，可以用农杆菌介导的方法，对多种子囊菌进行基因转化。其上含有一个由TrPC启动子控制的抗潮霉素基因作为选择标记，还带有一个由稻梨形孢菌组蛋白H3基因启动子控制的绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因。但是本课题组在前期研究中用这个质粒转化葡萄座腔菌时，发现转化效率低，绿色荧光蛋白表达很弱。

为此，本课题组构建了新的筛选标记，并整合到可用于农杆菌转化的载体上，建立了利用农杆菌介导的外源DNA高效转化体系，为该类真菌的遗传改造、开发有用的基因、分离病原真菌的药物靶点基因、研究该菌的基因功能等方面的研究开发提供了可行性方案。

发明内容

本发明提供了一种质粒载体，解决了现有质粒转化到葡萄座腔菌时，转化效率低的问题。

一种质粒载体，由pCAMBIA1300改造构建形成，在pCAMBIA1300多克隆位点插入葡萄座腔菌组蛋白H3基因启动子、葡萄座腔菌转录延长因子α基因启动子、抗性基因，所述抗性基因位于葡萄座腔菌转录延长因子α基因启动子的下游。