[发明专利]荧光定量PCR对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用引物

说明书

本发明公开了一种荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用的特异性引物，本发明的检测法包括以下步骤：1)、作为待测样品的鲐鱼进行DNA的提取；2)、设计荧光定量PCR中的特异性引物，设置荧光定量PCR体系；3)、以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物，进行荧光定量PCR扩增；从而检测鲐鱼中的腐败微生物。检测基因无特异性扩增曲线产生、C_t值≥35者，判定结果为阴性，即样品中未检出该基因所对应的微生物；C_t值小于35者，可判定该样品结果为阳性，即样品中能检出该基因所对应的微生物。

技术领域

本发明涉及一种适用于鲐鱼贮藏过程中腐败微生物的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)，鲈形目，鲭科，鲐属。又名：青花鱼，在我国各海域均有生产，以东海产量为多。继大小黄鱼、墨鱼、带鱼资源锐减以后，鲐鱼因其分布广、生长快、产量高已成我国近年主要经济鱼类之一。鲐鱼含有丰富的蛋白质和脂肪等多种营养，鲜食时味美，加工出来的咸品和干品也相当可口。但是食后发生过敏性食物中毒者却屡见不鲜，尤其是食用鲜度较差的鲜鱼，则更易发生中毒。对于食用鲐鱼引起的中毒问题，国内外的学者曾进行过较长时间的研讨，大多数认为：引起中毒的原因是鲐鱼含有的组胺所致。当鱼体变质或鲜度较差时，细菌大量繁殖，可使鱼体内组胺酸脱羧基而形成组胺。在鲐鱼的贮藏过程中，常见的腐败相关微生物有希瓦氏菌、弧菌、李斯特菌等。

如何经济有效地延长鲐鱼的货架期，从而扩大销售半径，是目前鲐鱼冷藏、贮藏产业链面临的一个主要问题。国内外对冷藏鱼类货架期研究表明，新鲜鱼类货架期受鱼种类、大小、生理状况及贮藏条件等多种因素影响，冷藏期间不同种类的鱼品质变化规律不同，货架期也有很大差异。若能正确处理原料鱼，采用冰藏及冷却链流通可以有效延长货架期。

目前，鲐鱼腐败菌的检测常采用微生物平板计数法：分离，提纯菌种，再进行菌落生理生化鉴定是一个比较繁琐的过程，存在检测周期长，工作量大的缺点，不能适应快速检测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用的特异性引物，采用本发明的方法可轻易判断鲐鱼的新鲜度。

为了解决上述技术问题，本发明提供荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法中所用的特异性引物，该特异性引物由以下至少任意一种组成：

表1

上述序列(hdc基因)：D＝G/A/T，Y＝C/T，M＝A/C，H＝A/T/C，R＝A/G。

本发明还同时提供了一种荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法，依次进行以下步骤：

1)、作为待测样品的鲐鱼进行DNA的提取；

2)、设计荧光定量PCR中的特异性引物，设置(优化)荧光定量PCR体系；

3)、以基因组DNA(步骤1)所得DNA)为扩增模板，用上述特异性引物，进行荧光定量PCR扩增；从而检测鲐鱼中的腐败微生物。

作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的改进：所述特异性引物如上表1所述。

作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的进一步改进：

所述步骤2)荧光定量PCR扩增体系为：20μL总体积中含有SYBER Green Ex Taq(2×)10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，DNA模板(浓度为1.287×10⁴μg/μL～1.200×10⁸μg/μL)1.0μL，补水至20μL。