[发明专利]一种土壤微生物定性与定量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种土壤微生物定性与定量的检测方 法。

背景技术

土壤微生物是环境污染的重要指标，也关系着食品的安全，因此，土壤微 生物精确地定性与定量检测与监控是十分必要的。

现有土壤微生物定性与定量检测技术包括形态学计数、芯片检测、16SrRNA 测序、宏基因组测序和实时定量PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式 反应)。形态学计数检测需要对微生物进行预培养，耗时长，不可培养微生物不 可检测，一次仅能够检测一种微生物，通量低，在计数时抽样量有限，且结果 粗糙，无法对种以下的分类单元进行区分。芯片检测所需的待测样品的DNA量 大，需要对微生物进行预培养及富集处理，检测结果不准确，且无法做定量检 测。16SrRNA测序无法对种以下的分类单元进行区分。宏基因组测序深度有限， 对于低含量的微生物的定量检测准确度很差。实时定量PCR一次只能检测一种 微生物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，无法计算微生物定性与定量的 可靠性，使得结论实用性差。

发明内容

为了解决现有技术中微生物定性与定量检测不准确的问题，本发明实施例 提供了一种土壤微生物定性与定量的检测方法。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种土壤微生物定性与定量的检测方法，所述方法包 括：

确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存 在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为土壤；

根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目 标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微 生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；

制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述 目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域 的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所 述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；

向所述待测样品中加入所述参考微生物和所述混合多重扩增引物不能扩增 的外源核酸，获得混合样品；

提取所述混合样品的核酸；

利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩 增产物；

利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；

根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行 定性和定量分析。

具体地，所述目标微生物类群的数目≥1个，且每个所述目标微生物类群包 括≥0种所述目标微生物；

所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原 体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种；

所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原 体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种。

具体地，所述确定待测样品中的非目标生物的方法包括：将所述非目标生 物确定为除所述目标微生物类群之外的所有生物，若能获得所述目标微生物类 群的特征区域，则所述非目标生物指除所述目标微生物类群之外的所有生物； 若不能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指所述混合样 品中，除所述目标微生物类群之外的其它生物。

具体地，所述目标微生物类群的特征区域为所述目标微生物类群内的微生 物的参考基因组上的核酸序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列 在所述参考基因组中为单一序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序 列在所述目标微生物类群内不同微生物间保守；所述目标微生物类群的特征区 域的区分度≥3；

所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源；所述 目标微生物的特征区域的m2值≥2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域 与所述目标微生物类群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基 数的最小值；