[发明专利]一种土壤微生物定性与定量的检测方法

权利要求书

1.一种土壤微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存 在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为土壤；

根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目 标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微 生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；

制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述 目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域 的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所 述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；

向所述待测样品中加入所述参考微生物和所述混合多重扩增引物不能扩增 的外源核酸，获得混合样品；

提取所述混合样品的核酸；

利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩 增产物；

利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；

根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行 定性和定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的数目 ≥1个，且每个所述目标微生物类群包括≥0种所述目标微生物；

所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原 体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种；

所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原 体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定待测样品中的非目 标生物的方法包括：将所述非目标生物确定为除所述目标微生物类群之外的所 有生物，若能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指除所 述目标微生物类群之外的所有生物；若不能获得所述目标微生物类群的特征区 域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所述目标微生物类群之外的其它 生物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的特征 区域为所述目标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核酸序列；所述目标 微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述参考基因组中为单一序列；所述目 标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述目标微生物类群内不同微生物间 保守；所述目标微生物类群的特征区域的区分度≥3；

所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源；所述 目标微生物的特征区域的m2值≥2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域 与所述目标微生物类群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基 数的最小值；

所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列； 所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为 单一序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的 其它生物中不具有同源性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述区分度是指由同一所述 混合多重扩增引物扩增的任一所述目标微生物类群的特征区域与任一非特征区 域间的差异碱基数的最小值，其中，所述非特征区域是所述混合多重扩增引物 以所述混合样品的核酸为模板的扩增产物，且所述非特征区域不为所述目标微 生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则所述区分度＝3×L1/4，其中，L1 为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。