[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测 试剂盒。

背景技术

目前，国内PRRSV抗体检测试剂盒质量方面参差不齐。其中美国IDEXXPRRSELISA 试剂盒被世界范围内广泛认可。但是由于其高昂的价格(包装2×96孔板的试剂盒售价为￥ 5500，包装5×96孔板的试剂盒售价为￥13000)极大限制了其在国内市场的广泛应用。

此外，国内自主研发、生产的PRRSELISA试剂盒多存在敏感性和特异性不好、重复 性差等问题。

酶联免疫吸附试验(ELISA)因其条件要求低，操作简单，稳定性好，特异性敏感性 高适用于基层兽医工作，现已被广泛应用于PRRSV抗体检测。目前，市场上商品化的PRRSV ELISA检测试剂盒多为N蛋白作为包被抗原。

近年来研究表明PRRSV的nsp1α/β、nsp2、nsp4和nsp7等非结构蛋白能够诱导强烈 的体液免疫反应。Brownetal.(2009)研究表明，相对于PRRSVN蛋白，nsp1α/β、nsp2、nsp4 和nsp7在免疫后126天仍然保持高水平的抗体滴度，并且持续到免疫后202天能然可以检测 到抗体。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种特异性好、重复性佳且价格实惠的 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒。

本发明的技术方案为：

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒 ELISA抗原包被板、样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、TMB 底物液、终止液、浓缩洗涤液；

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板中的抗原为抗猪繁殖与呼吸征 病毒细胞株DY株的NSP7-777基因片段与pET-32a利用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切得 重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；

所述样品稀释液为PBS缓冲液和10％小牛血清的混合液；

所述封闭液为5％-15％的牛血清；

所述终止液为2M的硫酸水溶液；

所述浓缩洗涤液为10×PBS缓冲液。

作为优先方案，所述样品稀释液中，PBS缓冲液和10％小牛血清的体积比为8:1- 10:1，所述PBS缓冲液的pH值为7.4；所述浓缩洗涤液的pH值为7.4。

作为优先方案，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒包括两个96T的猪繁殖 与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板；包括两个96T的样品稀释板；阳性对照血清的体积为 3mL；阴性对照血清的体积为3mL；酶标二抗的体积为25毫升；样品稀释液的体积为25毫升； TMB底物液的体积为25毫升；终止液的体积为13毫升；浓缩洗涤液为10×浓缩洗涤液且其体 积为45毫升。

作为优先方案，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板是采用96孔 COSTAR酶标板包被所述重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；具体包被方法为：用 包被液将pET777所表达并纯化的蛋白质稀释至蛋白含量为100ng/100uL，在每板的反应孔 中加入100uL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗5次，中间震荡；每孔中加入 200uL封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时；然后洗涤液冲洗5次，拍干水分， 置37℃烘干后，真空包装；所述包被液为PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，所述洗涤液为10× PBS缓冲液，所述封闭液为5％-15％的牛血清。

作为优先方案，所述重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质由重组表达载体 pET777转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达；所述纯化的具体步骤为：

A.破菌收集上清，将收集的上清用0.45纳米的滤膜过滤；

B.过HisTrap_TMFF镍柱纯化。

进一步地，过HisTrap_TMFF镍柱纯化的具体步骤为：

a.用pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，PBS缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为 5mL/min；

b.用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，该缓冲液的体积为5-10个柱床 体积，流速为5mL/min；