[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒

权利要求书

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒 ELISA抗原包被板、样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、TMB 底物液、终止液、浓缩洗涤液；其特征在于：

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板中的抗原为抗猪繁殖与呼吸征病毒细 胞株DY株的NSP7-777基因片段与pET-32a利用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切得重组表 达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；

所述样品稀释液为PBS缓冲液和10%小牛血清的混合液；

所述封闭液为5%-15%的牛血清；

所述终止液为2M的硫酸水溶液；

所述浓缩洗涤液为10×PBS缓冲液。

2.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述样品 稀释液中，PBS缓冲液和10%小牛血清的体积比为8:1-10:1，所述PBS缓冲液的pH值为7.4；所 述浓缩洗涤液的pH值为7.4。

3.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：包括两个 96T的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板；包括两个96T的样品稀释板；阳性对照血 清的体积为3mL；阴性对照血清的体积为3mL；酶标二抗的体积为25毫升；样品稀释液的体积 为25毫升；TMB底物液的体积为25毫升；终止液的体积为13毫升；浓缩洗涤液为10×浓缩洗 涤液且其体积为45毫升。

4.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪繁 殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板是采用96孔COSTAR酶标板包被所述重组表达质粒 pET777所表达并纯化的蛋白质；具体包被方法为：用包被液将pET777所表达并纯化的蛋白 质稀释至蛋白含量为100ng/100uL，在每板的反应孔中加入100uL，4℃过夜；次日，弃去孔内 溶液，用洗涤液冲洗5次，中间震荡；每孔中加入200uL封闭液于上述已包被之反应孔中，置 37℃温育2小时；然后洗涤液冲洗5次，拍干水分，置37℃烘干后，真空包装；所述包被液为 PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，所述洗涤液为10×PBS缓冲液，所述封闭液为5%-15%的牛血 清。

5.如权利要求1或4所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述 重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质由重组表达载体pET777转化到大肠杆菌BL21 中，经IPTG诱导表达；所述纯化的具体步骤为：

A．破菌收集上清，将收集的上清用0.45纳米的滤膜过滤；

B.过HisTrap_TMFF镍柱纯化。

6.如权利要求5所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：过 HisTrap_TMFF镍柱纯化的具体步骤为：

a.用pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，PBS缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为 5mL/min；

b.用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，该缓冲液的体积为5-10个柱床体 积，流速为5mL/min；

c.将过滤后的上清上样，流速为2mL/min，使目标蛋白充分挂柱；上样完后用含30mM咪 唑的pH为7.4的PBS缓冲液再洗5个柱床体积，流速为5mL/min，洗去杂蛋白以及未结合的 蛋白；

d.用含100mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液，进行洗脱，流速为5mL/min；

并在洗脱峰处收集洗脱液；

e.将收集的洗脱液用50mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超 滤浓缩，分装成每管1mL，取1mL4℃备用，其余-80℃保存。