[发明专利]棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法， 属于生物技术领域。

背景技术

内生菌是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。研究 表明，内生菌的用途非常广泛，在农业生产方面，人们利用内生菌来增强其宿主的抗逆性， 抗虫害，促进植物的生长，增强宿主植物的环境适应能力，避免宿主受到迫害，这样既减少 了化学农药的大面积污染，又保证了农作物的天然性。在医学方面，从内生菌中寻找更多抗 癌和抗病的基因也成为现在的研究热点。在工业方面，内生菌产生的某些活性物质，如具有 抗性的特殊的酶类，在工业上也具有较大的应用潜力。

一般情况下，内生真菌与宿主是以互惠的方式进行共生，所以通常认为两者是互利共生 的关系。一方面，宿主植物为寄生的内生真菌提供生存环境和生长必须的养分；另一方面， 内生真菌会产生有利于宿主植物生长和发育的次级代谢产物，这些代谢产物在宿主植物应对 抗病虫害、抗旱和对病原体的拮抗时发挥了重要作用。

迄今为止已被发现的内生真菌包括接合菌、卵菌、担子菌、子囊菌、有丝分裂孢子真菌 和其无孢菌等多种菌群，其中曲霉属、镰孢霉属和拟茎点霉属为较优势的菌种。而从耐盐植 物种直接分离棘孢木霉还属于空白。

植物在逆境下产生的大量逆境乙烯阻碍其正常生长发育，严重时可导致植株死亡。ACC 脱氨酶可将植物乙烯合成的直接前体ACC水解为α-酮丁酸和氨，阻止植物内体乙烯的过量 产生，有效促进逆境下植物的正常生长发育及延缓植物组织的衰老。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方 法及其蛋白表达方法，该毕赤酵母表达载体能够成功表达ACC脱氨酶，具有良好的耐盐性。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母 表达载体，将棘孢木霉的ACC脱氨酶基因和质粒pPIC9K连接后，转化毕赤酵母构建而成。

所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)KpS，保藏单位：中国典型培养物保 藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015770，保藏日期：2015 年12月23日。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构 建方法，包括以下步骤：

(1)根据棘孢木霉菌株T203ACC脱氨酶基因，设计特异性引物ACC，以棘孢木霉KpS 基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收纯化，并连接T载体，转化大肠 杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，得到大肠杆菌菌液，进行质粒抽 提并测序；

(2)根据步骤(1)的测序结果，设计特异性引物T-acdS，以步骤(1)大肠杆菌菌液为 模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物和载体质粒pPIC9K同时双酶切，两个酶切产物连接， 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，质粒抽提并酶 切鉴定，酶切鉴定正确的命名为重组质粒pPIC9K-acds；

(3)用Sacl线性化重组质粒pPIC9K-acdS，然后电转化毕赤酵母感受态细胞即得。

步骤(1)的特异性引物ACC为：

正向引物ACC-FP：5’-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’

反向引物ACC-RP：5’-GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3’。

步骤(2)的特异性引物T-acdS为：

正向引物T-acdS-FP：5’-TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’

反向引物T-acdS-RP：5’-GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3’。

步骤(1)的PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix12.5μl，基因组DNA0.5μl、10μM正 向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，补水到25μl；步骤(1)的PCR反应条件为：94℃预变 性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。