[发明专利]一种DNA高通量测序建库方法

说明书

本发明提供了一种适用于复杂环境中生物DNA的高通量测序建库方法，包括以下步骤：(1)对待测生物的基因组DNA进行片段化处理，获得DNA片段化物料；(2)对所述DNA片段化物料进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳胶块，切取所述电泳胶块中文库目的大小的片段至比所述文库目的大小的片段大40‑60bp的片段范围内的凝胶，回收凝胶内的DNA获得第一纯化DNA；(3)对所述第一纯化DNA进行末端修复，3`末端加A，连接接头序列获得连接产物，并对连接产物进行Solexa PCR扩增，获得文库。本发明方法操作简单，能够解决复杂环境中生物DNA(如：海带DNA、贝类DNA、石榴DNA等)建库困难的问题，且能够降低接头使用量，为高通量测序提供一种疑难样品的建库方案。

技术领域

本发明涉及基因高通量测序技术领域，具体地，涉及一种适用于复杂环境中生物的DNA高通量测序建库方法。

背景技术

在二代和三代测序技术中，构建高质量的测序文库是高通量测序的关键因素。测序文库的质量直接决定测序产出的数据质量，进而对数据分析有着莫大的关联。随着高通量测序技术的快速发展，各大试剂公司，包括Illumina、NEB、KAPA、Nugen等，已能提供多种文库制备的试剂或试剂盒，为DNA、RNA等形式的核酸样品的建库带来极大的便利，但是，在DNA核酸建库方面，并不是所有物种的DNA都能够顺利完成文库的构建。究其原因为这些DNA样品中含有大量杂质，特性与DNA相近，不能够通过调整DNA提取条件去除干净，且这些杂质对建库过程中酶反应产生抑制效应，使DNA修复不完全或接头连接效率低，最终导致文库产出量低。比较有代表性的一种生物类型是海洋生物，如海带、贝类等。利用上述各大公司提供的建库方法，海带、贝类DNA仍然不能得到有效的文库产出，因此迫切需要一种能够有效降低复杂环境中生物DNA杂质污染的影响，特别是降低海洋生物DNA中杂质污染的影响的建库方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的高通量测序建库方法中难以降低环境中杂质污染的影响的问题，提供一种能够有效避免环境杂质污染的DNA高通量测序建库方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种DNA高通量测序建库方法，包括以下步骤：

(1)对待测生物的基因组DNA进行片段化处理，获得DNA片段化物料；

(2)对所述DNA片段化物料进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳胶块，切取所述电泳胶块中文库目的大小的片段至比所述文库目的大小的片段大40-60bp的片段范围内的凝胶，回收凝胶内的DNA获得第一纯化DNA；

(3)对所述第一纯化DNA进行末端修复和在3`末端加A，末端加A后连接接头序列获得连接产物。

本发明所提供的DNA高通量测序建库方法能够在含有多糖、酚类物质、萜类、酯类等杂质污染的复杂环境下对生物DNA进行高通量测序文库构建，能够将样品中与DNA特性接近的杂质去除，提高高通量测序文库的质量。适用于那些按照本领域现有构建文库方法，获得的文库产出低，同时通过调节DNA纯度、反应体积、酶用量等手段仍然无法排除缺陷的，属于疑难样品的DNA。

可选的，所述待测生物为海洋生物，特别优选的，所述海洋生物为海带或贝类。本发明对于海带和贝类的具体种类没有特别的限制，包括所有已知和未知海带和贝类种类。

可选的，所述待测生物为石榴。

石榴籽中含有多糖、蛋白质、酯类等杂质物质的干扰，多糖与DNA或者RNA的理化性质相似，抽提过程中易与DNA形成胶状沉淀，导致最终提取的DNA纯度不高。而这些杂质会对建库过程中酶造成影响。本发明所提供的方法能够去除石榴籽中的杂质物质的干扰，获得高质量的测序文库。

其中，在步骤(1)中，进行片段化处理的方式包括但不限于超声波破碎、酶切破碎和微波破碎。

其中，在所述DNA片段化物料中，DNA片段的大小为180-600bp。