[发明专利]一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用

说明书

技术领域

本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，具体涉及一种用于鸡标记辅助选择的B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用。

背景技术

禽白血病(Avianleucosis，AL)主要是由禽白血病病毒(Avianleucosisvirus,ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类免疫抑制性肿瘤性传染病。禽白血病病毒不仅引发肿瘤，导致鸡群大批死亡，禽白血病病毒亚临床感染还常常引发生产性能，包括生长率、肉品质、产蛋率和受精率等降低、鸡免疫抑制和易致其他病原继发感染，给养禽业造成重大的经济损失。

目前，由于没有有效药物和疫苗，禽白血病的主要防控措施是降低鸡群的感染率以及建立无白血病的种鸡群，其主要手段是通过对鸡群定期进行禽白血病病毒(ALV)检测淘汰阳性鸡的方法来净化和消除鸡群中的ALV。然而，禽白血病净化是一项成本昂贵、工作量大且持久的工程；尤其在生产系统低下且养殖环境复杂的发展中国家，净化措施并不能完全控制禽白血病的发生与流行。因此，通过抗病育种改善宿主抗病力被人们认为是防控禽白血病的一项新策略。

B亚群禽白病病毒是我国肉鸡主要流行的禽白血病病毒之一。研究表明，B亚群禽白病病毒通过与宿主上的特异性受体结合侵染动物机体，编码B亚群禽白病病毒受体的tvb基因突变与禽白血病抗性相关，如位于c.172C>T突变使受体基因tvb产生提前终止密码子，影响受体与病毒的结合，从而使宿主产生抗B亚群禽白血病病毒感染的能力。我们前期在tvb基因第4外显子上发现一个新突变c.298C>T，该突变同样可导致tvb产生提前终止密码子，从而使宿主产生B亚群禽白血病病毒抗性。但目前关于tvb基因c.298C>T位点作为B亚群禽白血病遗传抗性分子标记的检测方法研究还较少。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种鸡B亚群禽白血病抗性的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用。

本发明以鸡B亚群禽白血病病毒受体基因tvb的DNA全长序列(参考序列GeneBank登录号为NC_006109.3)为研究对象，寻找该受体基因上影响鸡B亚群禽白血病抗性突变位点以及相应的多态性检测方法，通过在多个群体中的验证，发现了位于鸡B亚群禽白血病病毒受体基因tvb的某段序列(SEQIDNO：3)中的第166位碱基具有单核苷酸多态性。且当该处碱基为C时，鸡为B亚群禽白血病易感型，当该处碱基为T时，鸡为B亚群禽白血病抗性型。

本发明的第一个目的是提供一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法，通过检测鸡tvb基因的DNA片段上的第166位SNP位点是否发生突变来鉴别被检测鸡为遗传抗性型还是遗传易感型；

当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为C时，则判断所述鸡为B亚群禽白血病易感型；当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为T时，则判断所述鸡为B亚群禽白血病抗性型。

优选的，所述方法包括如下步骤：

(1)以所述鸡tvb基因的DNA序列为模板，设计引物对所述鸡tvb基因的DNA片段进行扩增；

(2)将所得扩增产物用限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测所得酶切产物；

若只有一条509bp的条带，则该突变位点处均为C碱基，判断为CC基因型，表现为B亚群禽白血病敏感型；

若有2条分别为343bp和166bp的条带，则该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因型，表现为B亚群禽白血病抗性型；

若有3条分别为509bp、343bp和166bp的条带，则该突变位点处一条链为C碱基，另一条链为T碱基，判断为CT基因型，因为C等位基因是显性，所以表现为B亚群禽白血病敏感型。

优选的，所述步骤(1)中的引物如SEQIDNO：1～2所示：

正向引物：5'-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3'，

反向引物：5'-GGTGATGATGATCCATAAAGC-3'。

优选的，所述步骤(2)中的限制性内切酶为BsaAI酶。

本发明的第二个目的是提供一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别试剂盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物、PCR反应混合物、TaqDNA聚合酶、双蒸水、缓冲液和限制性内切酶BsaAI，所述正向引物和反向引物的序列为：

正向引物：5'-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3'，