[发明专利]一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明提供了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应；所述裂解液的组成为：0.2～0.4N氢氧化钠、0.3～0.6M氯化钾、0.01～0.05％N‑月桂酰肌氨酸钠、5mM EDTA、0.3～0.6M Tris‑HCL和1～2％曲通X‑100。本发明方法不需要加热，室温裂解时间5～10分钟左右即可，只需静态洗涤一次，从而减少了实验室污染和磁珠核酸的丢失，避免了分步操作所带来的污染可能性，节省了检测时间。其敏感性以HBV DNA定量为例，可低至5IU/ML，重复性良好。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种根据生物体内 DNA复制性质而设计的体外快速扩增特定DNA序列的技术。PCR反应体系主要由核酸引物、4种dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反应缓冲液体系组成。自美国Cetus公司人类遗传室KaryMullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其衍生技术就被快速开发出来，并在多种核酸检测中得到了广泛的运用。尤其是病毒或其他病原体的检测，当知道待检病原某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR扩增，使其达到检测量，通过适当的检测手段进行检测，即可确定病原体的存在与否。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用DNA 扩增过程中荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与普通的PCR相比。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，实现了PCR的定量分析。目前，实时荧光定量PCR技术在医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究及临床检测中得到了广泛应用。

目前应用于实时荧光定量PCR检测的核酸提取方法主要有四种，即碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱法和磁珠法。

磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附，而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱，从而得到纯净的核酸。

目前，临床实验室中使用的磁珠法核酸提取大多采用胍盐介导的方法，即在胍盐的作用下，使核酸分子吸附于磁珠，再经过洗脱得到靶核酸的方法。但其核酸提取与PCR扩增往往分别进行，并且提取过程中使用的胍盐裂解液不稳定，易受实验室条件及季节温度影响，洗脱过程中大多需要至少两步洗涤，才能够相对彻底地去除蛋白和盐分子，进而增加了整个实时荧光定量PCR检测过程的耗时。此外，由于核酸提取与PCR扩增不在同一载体中进行和洗涤次数的增加而导致的实验室污染以及核酸丢失都是影响检测结果准确性的重要原因。因此，需要找到一种磁珠法提取与PCR扩增在同一载体中进行，裂解效率稳定并且不需经过多次洗脱的核酸提取方法对提高临床检测质量具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中磁珠法提取核酸与实时荧光定量PCR扩增分别进行并且需要多次移管、核酸裂解效率不稳定、磁珠核酸洗脱导致核酸丢失、核酸污染等缺点，提供了一种在一管中进行核酸提取与扩增的实时荧光定量PCR方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR 反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应；