[发明专利]一种抗内毒素的偶联生物分子及其制备和应用

权利要求书

1.一种抗内毒素的偶联生物分子，其特征在于，所述偶联生物分子为通式(1)所示化合物，

Y-CLP-19-amPEG (1)；

其中，CLP-19为鲎抗内毒素因子模拟肽分子；Y为氢或乙酰基；amPEG的分子量为500-2000Da。

2.权利要求1所述的偶联生物分子的药用盐。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有权利要求1所述的偶联生物分子或权利要求2所述的药用盐。

4.权利要求1所述的偶联生物分子或权利要求2所述的药用盐在制备细菌杀灭药物或内毒素血症治疗药物中的应用；

所述细菌为大肠埃希菌或铜绿假单胞菌。

5.权利要求1所述的偶联生物分子的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)母体树脂Fmoc-CLP-19-CTC合成：

称取多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，以10％-50％的DMF溶液脱除多肽合成氨基酸树脂的Fmoc保护基团；依照CLP-19的氨基酸序列进行后续偶联，循环完成整个CLP-19肽链的合成，得到母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC；

(2)氮端衍生物Y-CLP-19-CTC制备：

将Fmoc-CLP-19-CTC母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干后加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控温；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干，从合成柱中取出合成的CLP-19肽衍生物树脂，置于冻干机中冻干，得Y-CLP-19-CTC；

(3)采用逐步合成法或片段合成法进行Y-CLP-19-amPEG分子的合成。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述逐步合成法包括以下步骤：

(1)全保护Y-CLP-19-amPEG的制备：

脱除Fmoc步骤：在圆底烧瓶中加入Fmoc-AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-14的整数，再加入15-50％六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min；旋蒸后用无水乙醚析出沉淀，抽滤获得DCM-EtOH/Et2O后重结晶2次，用P₂O₅真空干燥获得去Fmoc保护的AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-13的整数；

偶联步骤：在圆底烧瓶中加入AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-13的整数；保护氨基酸Fmoc-AAx-OH，其x取自2-19的整数；催化剂DMAP和DCM，溶解后加入DIC；20-40℃油浴中电磁搅拌，TLC检测反应过程；反应停止后进行旋蒸，用无水乙醚析出沉淀，对沉淀进行抽滤并用无水乙醚洗涤3次，再用DCM/Et₂O或DCM-EtOH/Et₂O重结晶2次，茚三酮监测，应与空白颜色相同或相似，用P₂O₅真空干燥获得全保护的肽树脂Fmoc-AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-14的整数，称重计算收率；

重复上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，称重计算收率；

(2)CLP-19-amPEG制备

A.Fmoc-CLP-19-amPEG制备：全保护Fmoc-CLP-19-amPEG 1g，冰冷下加入10ml各组分体积比为90：5：3：2的裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-4h，氮气吹去大部分TFA，用无水乙醚沉淀后离心；DCM溶样，无水乙醚沉淀，离心分出固体；再重复2次，冻干，得到侧链无保护Fmoc-CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干、得到纯品，用氨基酸组成分析方法确认结构；

B.CLP-19-amPEG制备：将1g全保护Fmoc-CLP-19-amPEG除去Fmoc保护基后，按上述A法裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得到全保护的-CLP-19-amPEG粗品；该粗品以适量水溶解后用乙醚沉降，离心得固体；再重复2次，得较纯品；HPLC纯化，冻干，得纯品；用氨基酸组成分析方法确认结构。

7.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述片段合成法包括以下步骤：

A.脱除树脂：在母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC加入三氟乙醇裂解试剂，15-30℃反应60-120min后过滤，以DCM、THF依次洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出；加入H₂O析出白色固体后加入THF溶解，溶解后加饱和食盐水溶液进行分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥，得除去CTC树脂的全保护Fmoc-CLP-19-OH；

B.偶联amPEG：在全保护Fmoc-CLP-19-OH中加入DMF和THF，搅拌溶解后，加入体积比4-6倍的HOBt，冰水冷却下加入体积比4-8倍的DIC；搅拌，加入含有体积比1-4倍的amPEG的DMF溶液；撤除水浴，15-30℃搅拌18h后，置于25-40℃油浴搅拌反应，TLC跟踪反应进程；反应结束后转入较大的圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入冷冻的无水Et₂O，搅拌后静置；静置后抽滤并用无水Et₂O洗涤，真空干燥获得产物；上述产物加入DCM，搅拌全溶后加入冷冻无水Et₂O，搅拌后抽滤，无水Et₂O洗涤，真空干燥，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG；

C.除去Fmoc全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，加入piperidine的DMF溶液，25-40℃油浴搅拌反应，反应结束后转入较大的圆底烧瓶，加入冷冻的无水Et₂O，搅拌并抽滤，无水Et₂O洗涤，真空干燥后加入EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et₂O，搅拌后抽滤，用无水Et₂O洗涤，真空干燥，得到侧链全保护的CLP-19-amPEG；

D.裂解去保护：冰冷下在侧链全保护CLP-19-amPEG中加入各组分体积比为94∶3∶2∶1的裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-3h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降后离心；用DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干获得纯品。