[发明专利]用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法

说明书

本发明涉及药物基因组学领域，并且特别地涉及检测高甲基化DNA的存在或不存在。DNA标记中CpG甲基化的检测可用于癌症的诊断，并且本发明为此提供了改进的方法。这些改进的方法特别地允许在未甲基化DNA标记的高背景下更灵敏地检测甲基化DNA标记。

技术领域

本发明涉及药物基因组学领域，并且特别地涉及检测高甲基化DNA的存在或不存在.DNA标记中CpG甲基化的检测可用于癌症和癌症亚型的诊断，并且本发明为此提供了改进的方法.这些改进的方法特别地允许在未甲基化DNA标记的高背景下更灵敏地检测甲基化DNA标记.

背景技术

超过65年前，Mandel和Metais首次描述了在人中存在细胞外核酸的观察结果(Mandel P，Metais P.Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l′homme.C.R.Acad.Sci.Paris 142，241-243.1948)，并且在四十多年后，可以明确证明，在从血浆、血清和其他体液分离的无细胞核酸中可以发现肿瘤相关的遗传改变(FleischhackerM，Schmidt B.(2007)Circulating nucleic acids(CNAs)and cancer--a survey.BiochimBiophys Acta 1775：181-232；Jung K，Fleischhacker M，Rabien A.(2010)Cell-free DNAin the blood as a solid tumor biomarker-a critical appraisal of theliterature.Clin Chim Acta 411：1611-1624).这包括在不同形式的恶性肿瘤中观察到的表观遗传改变.DNA甲基化是哺乳动物染色质的标志，并且已知在CpG二核苷酸背景下的胞嘧啶甲基化在调节发育中发挥作用并且在例如胚胎发生和细胞分化的基本生物学过程具有重要意义(Smith ZD，Meissner A.(2013)DNA methylation：roles in mammaliandevelopment.Nat Rev Genet 14：204-220；Gibney ER，Nolan CM.(2010)Epigenetics andgene expression.Heredity(Edinb)105：4-13).因此，甲基化不仅调节基因转录，而且还在维持基因组稳定性、印记(imprinting)和X染色体失活中起重要作用.癌基因和肿瘤抑制基因中的表观遗传改变在癌症发生中具有关键的重要性(Suva ML，Riggi N，Bernstein BE.(2013)Epigenetic reprogramming in cancer.Science 339：1567-1570)。DNA甲基化模式在癌细胞中极大改变，因此可用于区分癌细胞与正常组织。因此，DNA甲基化模式被用于诊断所有类型的癌症。比较近的理念是使用从肿瘤释放到例如血液的游离循环肿瘤DNA进行甲基化分析，作为患者体内肿瘤负荷的指示.这种用非常灵敏且高度特异性的方法从肿瘤患者分离并表征细胞外核酸的能力导致产生术语“液体活检”.因此，医生不再仅依赖于组织活检和全身扫描的单一检查.在这样的液体活检中，在未甲基化非肿瘤DNA的高背景下检测少量的甲基化肿瘤DNA极大地挑战了该检测方法的灵敏度.而使用基于在重亚硫酸盐转化(bisulfite conversion)后选择性地扩增甲基化肿瘤DNA的技术(例如甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)，尤其是HeavyMethyl^TM(HM)技术)已取得了非常好的结果(Cottrell等，A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers.Nucleic Acids Res.2004年1月13日；32(1)：e10).