[发明专利]用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法

权利要求书

1.一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，所述方法包括以下步骤：

(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；

(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域的长度小于100个碱基对(bp)并且包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点，并且

其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物；以及

(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，

其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸的中间三分之一或3’端的三分之一内。

3.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在所述引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述靶DNA是基因组人FOXL2、SHOX2或PTGER4DNA，包括各自的启动子区以及其上游和下游5kb内的DNA。

5.甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂在制备用于在对象中检测癌症的存在或不存在的试剂盒中的用途，所述检测包括根据权利要求1至3中任一项所述的用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中：

-所述样品是来源于对象的样品，在患有所述癌症的对象中其包含癌细胞的肿瘤DNA，

-所述靶DNA在患有所述癌症的患者的癌细胞中是高甲基化的，并且

-所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在分别指示所述对象中所述癌症的存在或不存在。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述癌症是肺癌或结肠直肠癌。

7.一种试剂盒，其包含：

(i)至少一个由正向引物和反向引物组成的甲基化非特异性引物寡核苷酸对，其中所述引物对适于由基因组DNA的单链产生扩增子，在所述基因组DNA的单链中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物，并且其中所述扩增子的长度小于100bp且包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点；以及

(ii)至少一种能够以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸的中间三分之一或3’端的三分之一内。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在所述引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内。

10.根据权利要求7、8或9所述的试剂盒，其中所述基因组DNA的单链是人FOXL2、SHOX2或PTGER4 DNA的，包括各自的启动子区以及其上游和下游5kb内的DNA。