[发明专利]评估样品中甲基化基因座的量的方法

说明书

提供评估甲基化基因座的量的方法。在某些实施方案中，该方法包括：用MspJI家族成员消化含有基因组基因座的未甲基化和甲基化的拷贝的核酸样品以产生长度在20‑40个核苷酸的范围内的片段群，连接转接序列A和转接序列B至序列X的靶片段的相应端，及量化式A‑X‑B的连接产物的量。还提供了用于实施该方法的试剂盒。

交叉引用

本申请要求于2014年8月13日提交的美国临时申请序列第62/037,057号的权益，本申请为了所有目的通过引用并入。

背景

5-甲基胞嘧啶是甲基化形式的DNA碱基胞嘧啶，其据信参与转录调控。当胞嘧啶被甲基化时，DNA保持相同的序列，但是甲基化基因的表达可改变。

该化学物质的功能在物种之间显著变化：在细菌中，5-甲基胞嘧啶可在多个位点处存在，且通常用作保护DNA免受天然甲基化-敏感限制酶切除的标记物；在植物中，5-甲基胞嘧啶在CpG、CpHpG和CpHpH序列(其中H＝A、C或T)处存在；并且，在真菌和动物中，5-甲基胞嘧啶主要在CpG二核苷酸处发生。大部分真核生物仅甲基化小百分比的这些位点，但在脊椎动物中70-80％的CpG胞嘧啶被甲基化。

脊椎动物中的胞嘧啶甲基化通常在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即其中在DNA序列中胞嘧啶后面紧跟的是鸟嘌呤)处发生。Me-CpG的形成由酶DNA甲基转移酶催化。约80–90％的CpG位点在人DNA中被甲基化，但存在被称为CpG岛的某些区域，其中CpG二核苷酸均未被甲基化。这些与56％的哺乳动物基因的启动子(包括所有广泛表达的基因)相关。百分之一至二的人基因组是CpG簇，并且在CpG甲基化与转录活性之间存在相反关系。

本文所述的方法提供评估样品中甲基化基因座的量的方法。

概述

提供评估样品中甲基化基因座的量的方法。在某些实施方案中，该方法可包括：(a)用MspJI家族成员消化含有未甲基化和甲基化拷贝的基因组基因座的核酸样品以产生长度在20-40个碱基对的范围内并且具有中心甲基化胞嘧啶的片段群；(b)通过以下步骤连接转接序列A和转接序列B至序列X的靶片段的相应端：(i)在转接序列A和B的存在下使式B’-X’-A’的夹板寡核苷酸杂交至(a)的片段，其中X’、A’和B’分别与X、A和B互补，和(ii)连接转接序列A、序列X和转接序列B至彼此以产生式A-X-B的产物；和(c)定量式A-X-B的连接产物的量，从而提供核酸样品中甲基化基因座的量的估值。

该定量可使用任何方便的方法进行，所述方法包括通过qPCR或通过测序。在一些实施方案中，转接序列A和B可存在于相同的寡核苷酸分子中，并且步骤(b)的产物是环状核酸分子。在这些实施方案中，该定量可通过以下进行：(i)通过滚环扩增(RCA)扩增环状核酸分子，(ii)使RCA产物杂交至标记的寡核苷酸群，所述标记的寡核苷酸群杂交至RCA产物中的多个位置；和(iii)单独对标记的RCA复合物的数量进行计数。

如下面更详细地讨论，在某些情况下，该方法可以用于评估来自妊娠雌性的无细胞DNA样品中胎儿DNA的量。

还提供了用于实施该方法的试剂盒。

附图简述

熟练的技术人员将理解如下所述的附图仅用于说明目的。附图并不意在以任何方式限制本教导的范围。

图1示意性地说明了主题方法的实施方案的一些特征。

图2示意性地说明了主题方法的一个实施方式的一些特征。

图3示意性地说明了主题方法的另一个实施方式的一些特征。

图4示意性地说明了可对连接产物进行计数的方法。

定义