[发明专利]衔接子连接的扩增子的制备

说明书

本发明涉及分别用于制备衔接子连接的扩增子或靶DNA的测序文库的新方法和试剂盒。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地分别涉及衔接子连接的扩增子的制备，并且特别地涉及靶DNA的测序文库的制备。

背景技术

现代分子生物学技术中的许多应用需要衔接子连接的扩增的DNA片段。例如，衔接子连接的扩增子构成预期用于测序分析的靶DNA的文库。例如通过聚合酶链反应(PCR)对DNA样品中的靶区域进行扩增程序。随后将由PCR产生的扩增子连接到衔接子分子。然后对衔接子连接的扩增子或靶DNA片段进行测序反应。因此，DNA衔接子分子可具有对测序引物具特异性的核苷酸序列。衔接子连接的扩增子的所得群体被称为所谓的文库，特别是扩增子测序文库。

目前，有几种常见的产生扩增子测序文库的方法。

一种方法使用常规的多步酶促反应将衔接子连接到扩增子。这种方法例如公开于Illumina Manual,“Mate Pair Library Preparation”,2009中。扩增子通过PCR由靶特异性引物产生，然后进行末端修复。所述末端修复步骤通常需要两种酶：多核苷酸激酶，通常是T4多核苷酸激酶(PNK)，其分别将双链扩增子或PCR产物的5'端磷酸化；和具有聚合酶和核酸外切酶活性的酶，其使PCR产物的末端通过任一种填充和修整反应而钝化。在末端修复步骤之后，为了在一些平台(例如由提供的那些平台)上测序，所谓的A添加步骤需要添加腺嘌呤核苷酸。在该步骤中，例如通过克列诺片段(Klenow fragment)exo-(具有5'→3'聚合酶活性但缺乏3'→5'核酸外切酶活性和5'→3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的大片段)，将A突出端添加到末端修复的PCR产物的3'端。这是为了产生具有由胸苷核苷酸形成的突出端即T突出端的测序衔接子的对接侧。在A添加后，可以通过DNA连接酶(通常是T4DNA连接酶)将所述测序衔接子连接到扩增子。对于其它测序平台，例如来自Life的那些，例如Ion Torrent PGM或Proton、SOLid，无需A添加步骤并且将钝端衔接子直接连接到末端修复的扩增子。

另一种文库制备方法是使用含有靶特异性序列和一部分衔接子序列的融合引物。在第一轮PCR和靶特异性区域的扩增后，可以利用含有完整衔接子序列的引物进行第二轮PCR以将所述衔接子序列添加到扩增子。

文献WO 2009/072972公开了用于将dsRNA衔接子分子酶促连接到dsRNA分子的方法。

本领域中的所有这些方法都是繁琐和耗时的。此外，使用融合引物的方法也可以对合适PCR引物的设计产生挑战，所述PCR引物应该在相同的多重PCR反应中扩增数百到数千个扩增子，而不产生大量的非特异性产物。

在这种背景下，本发明的目的是提供一种制备衔接子连接的扩增子的方法，其中可以减少或避免与现有技术方法相关的问题。本发明的另一个目的是提供一种制备靶DNA的测序文库的改进方法。

本发明满足这些和其它需求。

发明内容

本发明提供一种制备衔接子连接的扩增子的方法，其包括以下步骤：

(i)使双链扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，

(ii)在同时允许以下的条件下温育所述反应混合物以获得衔接子连接的扩增子：

-通过所述多核苷酸激酶进行所述双链扩增子的5'磷酸化，和

-通过所述DNA连接酶将所述DNA衔接子分子与所述双链扩增子的至少一个末端接合。

本发明还提供一种制备靶DNA的测序文库的方法，其包括以下步骤：

(i)在产生所述靶DNA的双链PCR扩增子的条件下对所述靶DNA进行PCR，

(ii)使所述双链PCR扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，

(iii)在同时允许以下的条件下温育所述反应混合物以获得所述靶DNA的测序文库：

-通过所述多核苷酸激酶进行所述双链PCR扩增子的5'磷酸化，和

-通过所述DNA连接酶将所述DNA衔接子分子与所述双链PCR扩增子的至少一个末端接合。