[发明专利]衔接子连接的扩增子的制备

权利要求书

1.一种制备衔接子连接的扩增子的方法，其包括以下步骤：

(i)使双链扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，

(ii)在同时允许以下的条件下温育所述反应混合物以获得衔接子连接的扩增子：

-通过所述多核苷酸激酶进行所述双链扩增子的5'磷酸化，和

-通过所述DNA连接酶将所述DNA衔接子分子与所述双链扩增子的至少一个末端接合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述双链扩增子是双链PCR扩增子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述双链PCR扩增子由使用包含末端腺苷酰转移酶活性的DNA聚合酶的PCR产生。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA聚合酶选自：Taq聚合酶、克列诺片段、TopTaq聚合酶、Tfl聚合酶、Tma聚合酶、Tne聚合酶和Tth聚合酶。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA衔接子分子包含T突出端。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述多核苷酸激酶选自：T4多核苷酸激酶、T4多核苷酸激酶(3'磷酸酶活性缺失)。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA连接酶选自：T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶、Taq DNA连接酶和9°N DNA连接酶。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA衔接子分子是测序DNA衔接子分子，优选是用于下一代测序(NGS)的DNA衔接子分子。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于在步骤(i)中，通过将所述双链扩增子、所述至少一种多核苷酸激酶、所述至少一种DNA连接酶和所述DNA衔接子分子置于一个单独的反应容器中来实现所述接触。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于在步骤(ii)后，进行以下步骤：

(iii)分离衔接子连接的PCR扩增子。

11.一种制备靶DNA的测序文库的方法，其包括以下步骤：

(i)在产生所述靶DNA的双链PCR扩增子的条件下对所述靶DNA进行PCR，

(ii)使所述双链PCR扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

(iii)在同时允许以下的条件下温育所述反应混合物以获得所述靶DNA的测序文库：

-通过所述DNA连接酶进行所述双链PCR扩增子的5'磷酸化，和

-通过所述DNA连接酶将所述DNA衔接子分子与所述双链PCR扩增子的至少一个末端接合。

12.一种用于制备衔接子连接的PCR扩增子的试剂盒，其包括：

(i)至少一种多核苷酸激酶，

(ii)至少一种DNA连接酶，

(iii)DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

(iv)反应缓冲剂，其被配置以同时允许所述至少一种多核苷酸激酶和所述至少一种DNA连接酶的酶功能，和

(v)手册，其用于执行根据权利要求1至10中的任一项所述的方法。

13.一种用于制备靶DNA的测序文库的试剂盒，其包括：

(i)至少一种DNA聚合酶，其优选包含末端腺苷酰转移酶活性，

(ii)至少一种多核苷酸激酶，

(iii)至少一种DNA连接酶，

(iv)DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

(v)PCR缓冲剂，

(vi)反应缓冲剂，其被配置以同时允许所述至少一种多核苷酸激酶和所述至少一种DNA连接酶的酶功能，和

(vii)手册，其用于执行根据权利要求9所述的方法。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶是Taq聚合酶。

15.根据权利要求10至12中的任一项所述的试剂盒，其特征在于所述多核苷酸激酶选自：T4多核苷酸激酶、克列诺片段、TopTaq聚合酶、Tfl聚合酶、Tma聚合酶、Tne聚合酶和Tth聚合酶，优选地所述DNA连接酶选自：T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶和9°N DNA连接酶。