[发明专利]用于扩增核酸样品的等温方法

说明书

本发明提供核酸扩增和检测反应的两阶段方法，其适用于快速病原体检测或疾病诊断。具体说来，本发明提供一种方法，其包括第一阶段慢速扩增反应，接着是多个第二阶段快速扩增反应，对所述第二阶段快速扩增反应进行同时实时监测，且其中快速扩增速率指示目标位点的存在。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年7月16日提交的、名称为“Isothermal Methods forAmplifying Nucleic Acid Samples”的美国临时申请序列号62,025,345的权益和优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文中。

背景

发明领域

本发明提供了核酸扩增和检测反应的方法，其适用于快速病原体检测或疾病诊断。

2.背景信息。

基于核酸核苷酸序列互补性的核酸分析方法可直接分析遗传性状。因此，这些方法是用于鉴定遗传疾病、癌症、微生物等的非常强大的手段。然而，检测样品中以极少量存在的靶基因或核酸不太容易，且因此，靶基因或其检测信号的扩增是必需的。因此，体外核酸扩增技术(NAAT)是在研究和诊断的许多领域中用于检测和分析少量核酸的极有价值的和强大的工具。

NAAT技术允许以高灵敏度和特异性检测并量化样品中的核酸。NAAT技术可用于确定具体的模板核酸在样品中的存在，如通过进行具体的NAAT之后扩增产物(即扩增子)的存在所指示。反之，任何扩增产物的不存在指示模板核酸在样品中的不存在。这类技术在诊断应用中非常重要，例如用于判定病原体是否存在于样品中。因此，NAAT技术适用于检测和量化用于感染性和遗传疾病的诊断的特异性核酸。

可根据工序的温度要求对NAAT进行分组。例如，聚合酶链反应(PCR)是作为体外扩增核酸技术的最常见方法。此方法被坚定地确立为借助于基于指数扩增作用的高灵敏度的极佳检测方法。此外，由于扩增产物可作为DNA回收，所以此方法被广泛地应用为支持如基因克隆和结构测定的遗传工程技术的重要工具。然而，在PCR方法中，温度循环或专门的温度控制器是实践所必需的；扩增反应的指数进展在量化上造成问题；并且样品和反应溶液容易被外界污染，从而容许核酸错误地混合以用作模板(参见R.K.Saiki等人1985.Science230,1350-1354)。其他基于PCR的扩增技术，例如，基于转录的扩增(D.Y.Kwoh等人1989.Proc.Natl.Acad Sci.USA 86,1173-1177)、连接酶链反应(LCR；D.Y.Wu等人1989.Genomics 4,560-569；K.Barringer等人1990.Gene 89,117-122；F.Barany.1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,189-193)、以及限制扩增(美国专利号5,102,784)同样需要温度循环。