[发明专利]一种基于荧光共振能量转移技术的阿尔法1D受体筛选模型

说明书

技术领域

本发明属于药理学领域，利用细胞稳定转染技术，构建了肾上腺素α_1D受体拮抗剂药物的筛选模型，用于待测样品对α_1D的拮抗作用的高通量检测。

背景技术

α₁肾上腺素受体(A₁-adrenoceptor，α₁-AR)属于G蛋白偶联膜表面受体，广泛分布于血管平滑肌、脂肪、肝、肺、子宫、心肌等机体的各种器官、组织和细胞，并介导多种生理效应，在调节代谢和心血管、神经、消化、生殖、内分泌等系统的生理活动和病理改变等方面有重要的作用，因而受到广泛重视。根据国际药理联合会受体命名与药物分类委员会规定，将α₁受体分为α_1A、α_1B、α_1D3种亚型。

BPH为一种常见的老年病，发病率极高，常导致患者排尿困难、残尿、尿急、尿频、血尿、夜尿等，其主要治疗方法有手术法和药物疗法。近年来，有研究表明切除前列腺的患者常会发生性功能障碍等副作用，寻求安全有效的药物治疗方法对治疗前列腺增生具有重要意义。α₁肾上腺素受体拮抗剂能够减轻括约肌紧张程度和前列腺增生程度从而缓解症状，是目前公认的治疗BPH及由其引起的下尿路症状(LUTS)的首选药物。

在中国人的前列腺组织中，α_1A-AR的百分含量为30％，α_1B-AR为45％，α_1D-AR为25％。目前临床上应用的α₁受体拮抗剂，如哌唑嗪、多沙唑嗪等药物对α₁受体亚型缺乏选择性，由于α₁受体的广泛分布和重要生理功能，使用α₁受体拮抗剂常会出现体位性低血压、头晕、无力等副作用。故通过检测药物对α_1D的拮抗作用来考察在治疗过程中是否产生不良反应。

本实验通过建立肾上腺素α_1D受体拮抗剂药物筛选模型，为有效控药物在治疗前列腺增生中产生的不良反应具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于建立一种肾上腺素α_1D受体拮抗剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：

本发明利用稳转细胞株的方法建立了一种肾上腺素α_1D受体拮抗剂高通量筛选模型。

步骤一：α_1D受体拮抗剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：IP1标准稀释液在Paradigm中的读值。(n＝3，)

图2：Epinephrine作用不同细胞数所产生量效曲线EC₅₀的比较。(n＝3，)

图3：Tamsulosin拮抗CHO/α1D稳转细胞产生的量效曲线。(n＝3，)

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

一、α_1D受体拮抗剂筛选模型的建立

1、实验材料

CHO/α_1D细胞株、F12、10％FBS、400μg/mLG418、StimulationBuffer(SB)、CO₂培养箱、384孔板、Paradigm^TMDetectionPlatform。

2、实验步骤

(1)细胞培养

1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期。

2)将贴壁细胞经EDTA消化、离心后重悬，对细胞计数。

3)用培养基稀释细胞悬液，使细胞密度达到1.5×10⁵cells/mL，将此细胞悬液移入T25培养瓶中，在37℃/5％CO₂环境下培养细胞。

4)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选α_1D拮抗剂试验的CHO/α_1D细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。

(2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定