[发明专利]一种基于荧光共振能量转移技术的阿尔法1D受体筛选模型

权利要求书

1.肾上腺素α_1D受体拮抗剂药物筛选模型，其特征在于，包括步骤：

(1)α_1D受体拮抗剂筛选模型的建立与优化；

(2)阳性药验证模型可靠性；

(3)高通量筛选模型验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期，细胞密度为1.5×10⁵cells/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选α_1D拮抗剂试验的CHO/α_1D细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)配置IP-one标准稀释液、激动剂肾上腺素(Epinephrine)梯度稀释液需按照给定浓度配置，细胞分别稀释为6000cells/μL、4000cells/μL及2000cells/μL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)加样方法：a：将配置好的IP1标准稀释液加入384白板中，每孔10μl，三个复孔；b：将稀释好的肾上腺素溶液按每个浓度3个复孔，5μl每孔加入384孔板中，接着向其中分别加入配制好的不同浓度的细胞稀释液5μl。此时标准曲线和反应孔反应体积均为10μl。将TopSeal-A膜贴于板面并37℃孵育1h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)终止试剂配置：用Lysisbuffer(LB)将IP1-d2及anti-IP1稀释33倍，按1∶1混匀平衡室温后加入各孔，每孔10μL。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育1h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)配制α1D拮抗剂塔索罗辛(Tamsulosin)梯度稀释液：拮抗剂塔索罗辛母液浓度为100mM，用IP1StimulationBuffer逐级稀释为终浓度的4倍。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)加样方法：将稀释好的塔索罗辛溶液按每个浓度3个复孔，2.5μL每孔加入384孔板中。将配制的细胞溶液按每孔5μL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使7.5μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。将肾上腺素母液稀释成步骤(2)中测定的EC₉₀，每孔2.5μl加入对应的含HEAThydrochloride的384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使10μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37℃/5％CO₂下使之孵育45min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)按步骤(2)配制终止试剂。向每孔加入10μLIP1-d2/anti-IP1溶液(1∶1)。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育1h。

10.权利要求1-10中所述任一所述的方法在筛选肾上腺素α_1D受体拮抗剂药物的应用。