[发明专利]一种荔枝霜疫霉菌分子检测引物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种荔枝霜疫霉菌分子检测引物及其检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌特异分子检测。主要采用设计了一对荔枝霜疫霉菌的特异引物PvYF1：5’‑GTCCGAGTTTCTAGCAGATTG‑3’和PvYR1：5’‑ACGATAATACCGTGAGCGCC‑3’），经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在荔枝霜疫霉菌纯DNA、带菌的植株中特异性地扩增出片段长度为249bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其用法可用于生产实践中荔枝霜疫霉菌感染的植株中疫霉菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为荔枝霜疫霉菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明一种荔枝霜疫霉菌分子检测引物及其检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间荔枝霜疫霉病早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术

荔枝味佳、色美、营养丰富，是热带和亚热带地区水果，分布遍及海南、福建、广西、广东、台湾等省，具有重要经济价值。由荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii) 引起的荔枝霜疫霉病是荔枝最重要病害之一，严重影响荔枝产量、品质以及鲜果贮运和外销。该病最早在我国的台湾省发现，目前在福建、广东、广西、海南、云南、贵州、四川、台湾等地均有发生，不仅严重为害接近成熟的果实，也为害嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果，引起大量落果和烂果，产量损失高达80%以上，甚至绝收，造成巨大经济损失。近几年该病流行频率和流行程度有逐渐加重的趋势，已成为荔枝生产上的一个重要障碍。鉴于荔枝霜疫霉病的巨大破坏性，为防止该病扩散蔓延，建立快速有效的检测方法十分必要。

目前对荔枝霜疫霉病的检测大多仍沿用传统培养和血清学鉴定方法。传统的病原菌检测技术是在分离培养获得相应病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成，而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，因此以病原菌形态学特征为判断基础的传统病原菌诊断方法，因其耗时长，效率低，难以满足对荔枝霜疫霉病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。免疫血清学鉴定方法虽已建立，但血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，容易造成假阳性，这些方法的应用均受到一定的限制。

近年来随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术的应用在很大程度上弥补了传统方法的不足。这类方法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，在控制植物病害的传播、成灾中已经开始发挥重要作用。国内外学者利用基于ITS碱基序列设计引物对卵菌的分子检测开展研究，但是以ITS为靶序列设计引物存在难以区分近似种的问题。已有研究表明，三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Ratsarcoma)相关的基因，在酵母中同，该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。Ypt1基因含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内显子在不同种之间具有多变性，其保守序列和进化区域相互间隔，非常适合作为霜疫霉菌分子检测的靶标。因此，本研究分析了荔枝霜疫霉菌与其它30种卵菌在Ypt1基因序列上的差异，设计了特异性引物，并在此基础上建立了荔枝霜疫霉菌的PCR快速分子检测体系。此技术可应用于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中荔枝霜疫霉菌传统检测方法对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，且十分耗时，无法达到快速检验的问题，提供荔枝霜疫霉菌的特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速分子检测体系和程序。该方法可用于带菌植株的高灵敏度快速分子检测，此技术对于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。