[发明专利]基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测用SDA反应液

说明书

本发明公开了一种基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测用SDA反应液；本发明利用发夹型DNA模板合成银纳米团簇，并将其作为新型分子信标，在引物垂悬端富G序列介导的链取代等温扩增反应中，借助杂交产生的富G荧光增强效应，实现对胃癌血浆microRNA标志物的单个检测；特异性高、反应时间短、用料少、操作步骤简便，为建立快速简便的新型microRNA检测方法开辟了新方向。

技术领域

本发明涉及医学和分子诊断领域，是一种基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测法，特别是涉及一种基于发夹型DNA模板合成银纳米团簇探针结合链取代等温扩增的单个microRNA检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21nt的内源非编码小RNA分子，其可通过与mRNA之间精确或非精确互补配对，参与调控mRNA的表达水平。多个miRNA可协同调控一个mRNA，或一个miRNA也可同时影响多个靶基因，从而形成一个高度复杂的调控网络，影响着从分子到细胞再到组织水平的一系列生物功能。miRNA表达异常与疾病及癌症发生密切相关。尤为重要的是，已发现多种miRNA标志物可用于癌症早期诊断、预后及进程监控。其中，上海交通大学崔大祥课题组用微阵列芯片miRNA全基因组扫描结合qRT-PCR技术筛选得到miR-16-5p和miR-19b-3p两种血浆miRNA标志物，并指出二者可用于指示胃癌发生发展进程(Zhang,J.,Song,Y.,Zhang,C.,et al.(2015)Circulating miR-16-5p and miR-19b-3p as twonovel potential biomarkers to indicate progression ofgastriccancer.Theranostics,5,733-745.)。其中，qRT-PCR是进行miRNA定量检测的金标准，但由于其需分步进行逆转录和热循环扩增及检测，导致该法耗时且费力。所以仍有必要进一步发展便捷快速的miRNA检测新方法。

等温扩增技术的出现使核酸扩增技术因摆脱了热循环变性步骤和仪器的束缚，而受到了众多研究者的关注。作为第一代等温扩增技术，链取代扩增Strand-displacementamplification(SDA)受DNA修复中碱基切除修复机制的启发迅速发展起来，至今，已发展出包括多引物SDA(multiply primed SDA)，剪切诱导SDA(nicking-initiated SDA)，环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification(LAMP))和结构转换诱发SDA(structure-switching-triggered SDA)等多种亚型。其中，由于结构转换诱发SDA不需要特殊设计剪切位点和额外使用剪切酶，而仅通过待测靶核酸与发夹结构探针的结合并导致后者打开而诱导SDA反应，特别适合对短链核酸分子及miRNA进行检测。目前，常用于结构转换诱发SDA的检测探针是一端连接有荧光染料及另一端连接荧光淬灭子的发夹型DNA分子信标(molecular beacon(MB))，但由于其需要对DNA进行偶联修饰，使检测成本增高，检测应用受限。