[发明专利]一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用

权利要求书

1.一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、抗菌肽LfcinB基因的合成：

根据牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，选取氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2：上游5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’，再将核苷酸编码序列NO.2，设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，即得上游引物：5’-GATCCTTCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTCTAAC；下游引物：5’-TCGAGTTAGAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCATTGAAG，引入酶切位点后，氨基酸编码序列NO.1目标蛋白上游引入羟胺切割蛋白位点天冬酰胺—甘氨酸；

PCR扩增目的抗菌肽基因：

PCR反应体系：超纯水40μL，10×PCR含Mg₂⁺缓冲液5μL，2.5mmol/LdNTPs1μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，Taq酶1μL，共计50μL；

反应程序为：温度94℃保持5分钟后，温度94℃反应30秒，温度55℃反应30秒，温度72℃反应30秒，共进行30循环后，温度72℃保持10分钟；

PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，温度-20℃保存备用；

b、抗菌肽LfcinB基因重组载体的构建：

将步骤a中PCR产物与表达载体pGEX-4T-1用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，反应体系为载体pGEX-4T-142μL，EcoRI1.5μL，XhoI1.5μL，10×FastDigest缓冲液5μL，Total50μL分别混匀，温度37℃水浴20min；

连接产物转化到BL21大肠杆菌中，在含有抗生素氨苄青霉素的LB固体平板上挑选转化子，分别接种于含50μg/mL氨苄青霉素的4mLLB液体培养基中，温度37℃，220rpm振荡培养8-10h，提取质粒后，PCR鉴定，并命名为pGEX-4T-1LfcinB；

c、重组抗菌肽LfcinB基因的诱导表达：

重组菌pGEX-4T-1LfcinB经终浓度为1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导后，经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，与阴性对照相比，重组菌有明显浓集的目的蛋白表达条带，检测目的蛋白，即得牛乳铁蛋白肽。

2.一种如权利要求1所述方法获得的牛乳铁蛋白肽在制备抑制大肠杆菌和金色葡萄球菌中的应用。