[发明专利]DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型的引物组和方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用的引物组和方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

根据流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，A型流感病毒可分为18种HA亚型和11种NA亚型。但由于病毒依赖于RNA的RNA聚合酶缺少校对功能，导致其在复制过程中基因组的突变率较高。统计数据表明，我国已新发现包括H10N8、H5N2、H7N9在内的三种新发亚型禽流感病毒的感染，每年爆发的数量和季节性的差异也表明流感在不同宿主间交叉传播也愈加频繁。而传统的基于核酸扩增的鉴定手段往往不能快速的给予核酸信息，给病毒的全面准确检测带来了极大的挑战。

目前，二代高通量测序技术越来越广泛用于病原基因的分析，是大规模监测病毒基因组进化的重要手段。在流感病毒的研究上，传统方法分析鉴定病毒通常采用Hoffmann等设计的方法扩增流感病毒基因组全长，或者以病毒特异引物扩增分型基因片段，进行Sanger法克隆测序，该方法耗时长，劳动力成本高，不适合大规模检测使用。而二代高通量测序不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增。其基本测序方法是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库避免了Sanger测序法所需的繁琐克隆过程。同时，DNA条形码技术的便捷性大大适应了二代测序技术的发展，可无需扩增全长进定，且引物使用简单，只需通过使用一段标准DNA片段,在二代测序技术的辅助下，即可通过测序获取相应的型别信息。

研究人员曾用coI基因鉴别出了含禽流感病毒的26种野生鸟类，能准确的识别鸟类宿主禽流感病毒的脱落、研究候鸟流感流行病学的规律和宿主种群生态学。但对病毒亚型本身的条码技术开发尚未见相应报道。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题利用DNA条形码理念，寻找A型流感病毒适合的条形码序列，一方面足够保守能够利用条码引物进行A型流感病毒的大范围扩增，另一方面具备足够的变异能够区分密切相关的亚型。同时对扩增的条码片段进行高通量测序技术，以开发更加广谱、便捷的通用流感分型检测技术。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用的引物组，引物序列如下：

(1)

HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA

HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA

(2)

NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR

NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR。

利用上述本发明提供的引物组，还提供一种DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型的方法，包括下列步骤：

(1)基因组提取及反转录

(2)引物设计与PCR扩增

(3)IonTorrent测序

(4)生物信息学分析

(5)系统进化分析与遗传距离计算。

所述的基因组提取及反转录具体步骤为：

按QIAGenRNA提取试剂盒操作步骤提取RNA，每份病毒RNA样品溶解于50μL的RNase水，12000rpm离心2min，立即开始反转录，以U125’-agcaaaagcagg-3’为引物，参照TaKaRa公司1ststrandcDNASynthesisKitcDNA试剂盒使用说明加入试剂，RT反应条件为：30℃10min，42℃40min，70℃15min，-80℃保存。

所述的引物设计与PCR扩增具体步骤为：

在NCBI流感病毒库中，下载16种HA亚型和9种NA亚型的全长序列，同一区域同一年代只选一株为代表，设计DNA条形码引物，设计的引物和预期目的片段大小具体见下表：

利用HA条码引物进行PCR，设置程序为：94℃2min，30个循环{94℃1min，52℃，1min，72℃3min}，68℃10min；

扩增NA基因的保守条码片段，因扩增产物G+C含量百分比不同，退火温度会有差异，故PCR反应采用touch-down程序：

94℃2min；