[发明专利]DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型的引物组和方法

权利要求书

1.DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用的引物组，其特征在于，引物序列如下：

（1）

HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA

HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA

（2）

NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR

NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR。

2.DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）基因组提取及反转录

（2）引物设计与PCR扩增

（3）IonTorrent测序

（4）生物信息学分析

（5）系统进化分析与遗传距离计算。

3.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的基因组提取及反转录具体步骤为：

按QIAGenRNA提取试剂盒操作步骤提取RNA，每份病毒RNA样品溶解于50μL的RNase水，12000rpm离心2min，立即开始反转录，以U125’-agcaaaagcagg-3’为引物，参照TaKaRa公司1ststrandcDNASynthesisKitcDNA试剂盒使用说明加入试剂，RT反应条件为：30℃10min，42℃40min，70℃15min，-80℃保存。

4.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的引物设计与PCR扩增具体步骤为：

在NCBI流感病毒库中，下载16种HA亚型和9种NA亚型的全长序列，同一区域同一年代只选一株为代表，设计DNA条形码引物，

引物序列如下：

（1）

HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA

HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA

（2）

NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR

NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR；

利用HA条码引物进行PCR，设置程序为：94℃2min，30个循环｛94℃1min，52℃，1min，72℃3min｝，68℃10min；

扩增NA基因的保守条码片段，PCR反应采用touch-down程序：

94℃2min；

｛94℃30S，53℃30S每个循环递减1℃直到45℃；68℃45S｝；8个循环

｛94℃30S，50℃30S，68℃45S｝；30个循环

68℃10min；

-20℃保存。

5.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的IonTorrent测序具体步骤为：

扩增完毕后，进行电泳鉴定，用PCR纯化试剂盒进行纯化；

分别取100ng纯化产物，HA扩增产物用IonShear^TMPlusReagentKit进行酶切打断5min，NA扩增产物不需酶切，酶切产物需加入1.8倍体积AMPure^?XPBeads纯化，然后HA扩增产物加入IonXpress^TMBarcode1接头，NA扩增产物加入IonXpress^TMBarcode2接头，E-Gel胶选择片段构建文库；

用Platimun^?PCR扩增试剂盒进行文库扩增，IonLibraryTaqMan^?qPCRMix鉴定文库质量；

取70μL终浓度为50pmol/μL的工作文库IonChefSystem上机，进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314芯片中，上机IontorrentPGM进行高通量测序。