[发明专利]玉米抗氧化活性肽及其制备方法

权利要求书

1.一种高抗氧化活性的玉米肽，是以经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉为原料，采用蛋白酶协同酶解方式，获得具有抗氧化活性的多肽混合物，再通过超滤、离子交换层析、凝胶层析、反相色谱，逐级收集高活性且分子量在600-1400Da范围内的组分，最后通过质谱测序获得六个玉米肽的氨基酸序列；化学合成后评估玉米肽的体外抗氧化活性，最终获得一种高抗氧化活性玉米肽：CSQAPLA；该玉米肽对DPPH自由基清除的IC50值为0.12mg/mL；对超氧阴离子自由基清除的IC50值为0.39mg/mL;

所述反相色谱的分离步骤包括：

①半制备型反相色谱柱确定抗氧化肽的活性区域

称取20mgSephadexG-25分离所得活性组分溶于1mL的2%乙腈水溶液中，用0.22μm微孔滤膜过滤，色谱柱的型号为ProntoSILC18，φ10×250mm，10μm，流速为1.5mL/min，流动相A为含0.065%TFA的2%乙腈水溶液，流动相B为含0.05%TFA的80%乙腈水溶液，梯度洗脱60min，采用自动部分收集器收集开始出峰时的玉米肽组分，每管收集3mL，测定每管样品的抗氧化活性，确定活性区域在8、11和13管；

②分析型反相色谱柱分离抗氧化活性肽

将半制备反相色谱柱分离所得活性组分溶于2%乙腈水溶液中，进一步用分析柱进行分离纯化，分析柱的柱型为XselectCSH，φ4.6×150mm，3.5μm，检测波长为214nm，流速为1mL/min，上样量为20μL，流动相A为含0.065%TFA的2%乙腈水溶液，流动相B为含0.05%TFA的乙腈。

2.权利要求1所述高抗氧化活性玉米肽，其特征是所述的蛋白酶协同酶解方式，具体操作如下：取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉，加入一定比例的水配制底物浓度为10%(m/V)的悬浊液，先用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解，酶解条件为：加酶量2%，酶解温度50℃，pH7.7，时间75min；然后加入风味蛋白酶Flavourzyme进行协同酶解，酶解条件为：加酶量5%，酶解温度53℃，pH6.4，时间50min；酶解结束后酶解液在100℃条件下加热10min以钝化蛋白酶活力；酶解物离心弃沉淀，所得上清液为抗氧化活性肽的混合物。

3.权利要求1所述高抗氧化活性玉米肽，其特征是所述的超滤，具体工序如下：采用截断分子量6kDa的超滤膜对玉米蛋白酶解液进行超滤处理，获得＞6kDa截留液和＜6kDa透过液两种不同分子量的玉米肽组分；选择分子量＜6kDa的透过液作为下一步分离纯化的样品。

4.权利要求1所述高抗氧化活性玉米肽，其特征是所述的离子交换层析，具体工序如下：所使用的强阴离子交换剂为Q-SepharoseFastFlow，具体步骤是：将超滤所得＜6kDa的透过液稀释10倍，10000r/min离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，50mL滤液进行强阴离子交换层析，φ1.6×30cm；起始缓冲液：20mmol/LpH8.5Tris-HCl,洗脱液：含1molNaCl的20mmol/LpH8.5Tris-HCl，流速：2mL/min，UV214nm处检测；测定各管收集液的抗氧化活性，收集高活性部分备用。

5.权利要求1所述高抗氧化活性玉米肽，其特征是所述的凝胶层析，采用SephadexG-25，φ1.6×90cm，具体步骤是：将Q-SepharoseFastFlow的高活力样品冷冻抽干后，用双蒸水溶解后进行凝胶层析脱盐的同时进行分子量标定，标定用的标准物质为杆菌肽分子量1400Da和还原型谷胱甘肽分子量为600Da；测定各管收集液的抗氧化活性，收集分子量在600-1400Da范围内且高活性部分备用。