[发明专利]一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

黄酒麦曲是以轧碎的小麦为原料，经过加水拌曲、压块成型并堆放在一定的温度和湿度条件下，富集培养酿酒有益微生物制得的糖化发酵剂。麦曲中微生物群系复杂，是黄酒酿制的主要微生物来源，这些微生物在黄酒制作过程中共同作用，最终形成了黄酒独特的风格，因此黄酒麦曲有着“酒之骨”的美誉。

黄酒麦曲中微生物的研究一直是麦曲的研究重点，传统的分离培养不仅工作量大，耗时耗力，而且无法全面的了解微生物的组成，利用分子手段研究麦曲则能够避免传统方法的不便。利用分子手段分析一定环境下微生物群落结构时，基因组提取的质量对后续的分析有着很大的影响，高质量的提取麦曲中的宏基因组对全面的剖析麦曲微生物群落结构有着重要作用。

麦曲的制作在自然开放的环境中完成，且制曲时间较长(3个月左右)，微生物来源广泛(制曲用水、小麦、空气微生物等)，造就了麦曲复杂的微生物体系。相关研究中将麦曲制作过程中微生物的生长变化分为孢子发芽期、生长繁殖期和产酶成熟期3个阶段，之后麦曲还要经过长时间的放置过程，随着水分含量的降低，麦曲中的大量霉菌、细菌产生成孢子、芽孢，所以麦曲是一种含有真菌、细菌的营养体、孢子和芽孢的复杂体系，在进行群落结构解析时需要同时获得他们的基因组。麦曲在制作过程中经过了小麦轧碎的操作，小麦中含有丰富的淀粉、蛋白等营养物质，直接进入了麦曲体系，长时间的麦曲制作过程使其中的微生物能够充分的利用麦曲中各种营养物质，同时也产生了各种代谢产物，这都影响了麦曲中DNA的提取。麦曲中起重要作用的霉菌，如米曲霉、米根霉等在制曲完成后大多以孢子形式存在，孢子易于悬浮不易进入提取液，同时孢子不容易破坏孢子壁，这也将会阻碍提取过程。

麦曲总DNA的提取有着重重阻碍，而麦曲总DNA的提取是以分子手段研究麦曲的基础，因此亟需一种高质量提取麦曲总DNA的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对麦曲这种含有真菌、细菌营养体、孢子和芽孢的复杂微生物体系，提供了一种高质量从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法。

所述方法，包括：

(1)在麦曲中加入ddH₂O和吐温80，并加入玻璃珠，振荡摇匀，然后在超声波清洗器中振荡5～10min，使麦曲中的菌体尽量进入悬液中，低速离心后取上清；

(2)将步骤(1)得到的悬液高速离心的菌体沉淀；

(3)向步骤(2)得到的菌体中加入DNA抽提液，混悬后液氮条件下充分研磨；

(4)向步骤(3)得到的溶液中加入溶菌酶，于37℃条件下放置30～40min；

(5)向步骤(4)得到的溶液中加入加入SDS溶液并立即蛋白酶K，65℃水浴45～65min；

(6)向步骤(5)得到的溶液中加入CTAB抽提液，65℃水浴45～65min；

(7)将步骤(6)得到DNA粗提液进行纯化得到麦曲总DNA。

在本发明的一种实施方式中，所述用于提取的麦曲的质量为4～6g；ddH₂O的加量为12～18mL，吐温80的终质量浓度为0.04～0.06％；

在本发明的一种实施方式中，所述低速离心是指离心力为200～500g，高速离心是指离心力为10000～12000g。

在本发明的一种实施方式中，所述DNA抽提液配方为100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100mmol/L EDTA，pH 8.0，100mmol/LNa₃PO₄，1.5mol/LNaCl；

在本发明的一种实施方式中，所述DNA抽提液添加量为500～600μL。

在本发明的一种实施方式中，所述溶菌酶的质量浓度为50mg/mL，加入量为8～12μL；

在本发明的一种实施方式中，所述SDS的终质量浓度为1.8～2.2％；蛋白酶K的质量浓度为20mg/mL，加入量为4～6μL。

在本发明的一种实施方式中，所述CTAB抽提液的配方为2％CTAB，1.4mol/LNaCl，1mol/L Tris-HCL，0.5mol/L EDTA；CTAB抽提液的加量为700～1200μL。