[发明专利]一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法

权利要求书

1.一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

(1)在麦曲中加入ddH₂O和吐温80，并加入玻璃珠，振荡摇匀，然后在超声波清洗器中振荡5～10min，使麦曲中的菌体尽量进入悬液中，低速离心后取上清；

(2)将步骤(1)得到的悬液高速离心的菌体沉淀；

(3)向步骤(2)得到的菌体中加入DNA抽提液，混悬后液氮条件下充分研磨；

(4)向步骤(3)得到的溶液中加入溶菌酶，于37℃条件下放置30～40min；

(5)向步骤(4)得到的溶液中加入加入SDS溶液并立即蛋白酶K，65℃水浴45～65min；

(6)向步骤(5)得到的溶液中加入CTAB抽提液，65℃水浴45～65min；

(7)将步骤(6)得到DNA粗提液进行纯化得到麦曲总DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，每4～6g麦曲中添加12～18mLddH₂O和终质量浓度为0.04～0.06％的吐温80。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA抽提液配方为100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100mmol/L EDTA，pH 8.0，100mmol/LNa₃PO₄，1.5mol/LNaCl。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA抽提液的添加量为500～600μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶的质量浓度为50mg/mL，加入量为8～12μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SDS的终质量浓度为1.8～2.2％；蛋白酶K的质量浓度为20mg/mL，加入量为4～6μL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CTAB抽提液的配方为2％CTAB，1.4mol/L NaCl，1mol/L Tris-HCL，0.5mol/L EDTA；CTAB抽提液的加量为700～1200μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低速离心是指离心力为200～500g，高速离心是指离心力为10000～12000g。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA粗提液的纯化方法是将样品用等体积的氯仿与异戊醇体积比为24:1的氯仿-异戊醇抽提2～3次，然后用0.6～0.7倍体积的异丙醇沉淀，离心取沉淀，用1ml 70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，去除水分，干燥得DNA，然后加入ddH₂O溶解DNA，并加入10～20μL/mL的RNA酶处理，以去除DNA。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA粗提液的纯化方法具体是：所得样品用等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)混均后于4℃条件下，12000g，离心10～15min，抽提2～3次；以0.6～0.7倍体积的异丙醇于-20℃沉淀1h；4℃，12000g离心10min，收集核酸沉淀；加入1ml 70％的乙醇于4℃条件下，12000g，离心10min，洗涤沉淀2～3次，倒扣去除过量水分，于37℃干燥DNA；加100μL ddH₂O溶解沉淀，加入终浓度为10～20μL/mL的RNA酶，并在37℃下消化30～45min，以去除RNA。