[发明专利]一种细胞源性质控品的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞系质控品制备方法，具体讲，涉及一种细胞源性质控品的制备方法及其应用。

背景技术

随着生物技术及分子生物学的发展，各种疾病诊断试剂盒也越来越多，随着技术的成熟，其中的质控品部分是检测试剂盒非常重要的组成部分，特别是定量检测试剂盒。目前市面上的试剂盒质控品主要使用的是质粒，质粒适用范围广，几乎所有的基因检测类试剂盒质控品均可选择使用质粒。但是质粒制备不仅过程繁琐，而且需要在-20℃下低温储存，随着冻融次数增加，降解情况严重，稳定性不好，给试剂盒质控带来诸多不便；同时质粒作为一种质控品，与待检样本同源性存在较大差异，特别是一些需要定量检测的产品，用质粒进行定量不具有说服力；并且对于不同批次间的产品，也会由于质粒的生产时间不同而导致检测结果的不同，给疾病检测带来诸多不便。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明提供一种细胞源性质控品的制备方法；

本发明提供一种细胞源性质控品在肿瘤基因突变检测中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：一种细胞源质控品的制备方法，包括如下步骤：

(1)、细胞的准备

1)细胞的复苏：提前备好42℃的温水，按要求从液氮罐中取出对应细胞冻存管，立即放入备好的温水中快速摇动，直至管中的液体恢复常温。于超净台中将冻存管用质量百分含量75％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加5mL培养液。在1500r/min速度下离心5分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养皿中，置37℃温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时进行传代。培养过程中严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败；

2)细胞传代培养：本步骤须在超净台中操作。取生长适宜的培养细胞，吸去培养皿中的培养液，沿皿壁加入2mL(视培养皿大小加入适量即可)的1xPBS轻轻清洗细胞，吸去PBS；再用PBS再清洗一次；

向培养皿中加入0.5mL的质量百分含量为0.25％胰酶，轻轻摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化，1min后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，若细胞基本恢复圆滑状态，即可进行下一步操作，若还有贴壁情况，则继续消化直至细胞变得圆滑。注意胰酶消化时间过短过长都不好，过短消化不完全，过长可能对细胞膜造成一定损伤，都不利于细胞的继续传代；

向培养皿中加入3mL培养液(视培养大小加入适量即可)，用移液器将皿底细胞轻轻来回吹打混匀，显微镜下观察细胞浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入600～1500μl的细胞悬浮液，并加入3mL培养液，用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下观察细胞密度。注意步骤中的培养液及细胞悬浮液均可根据实际情况进行变动；

置37℃温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时进行传代；

3)细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，当需要收集时，在用胰酶消化完全后可加入适量PBS，然后直接回收到离心管中。或者不加PBS直接收集胰酶消化的细胞。收集完毕的细胞可暂时放在0℃冰箱保存，长时间不用的细胞最好保存在-80℃冰箱中备用；

(2)、细胞的石蜡包埋

1)细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5分钟，弃上清；

2)细胞固定：向离心管中加入适量的质量百分含量10％的中性福尔马林，摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一次，1500r/min离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞；

3)细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离心5分钟，弃上清：50％乙醇30分钟；

70％乙醇30分钟；85％乙醇30分钟；95％乙醇30分钟；100％乙醇20分钟；100％乙醇20分钟；

4)石蜡包埋：在62℃环境下于通风橱中进行操作，具体操作如下：1/2体积二甲苯加1/2体积的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞进行初步包埋，待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后进行二次包埋，用石蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。

作为本发明的优选方案，所述步骤(1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存，具体步骤如下：