[发明专利]一种3α‑HSD试剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种3α-HSD试剂及其制备方法和应用。

背景技术

3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD，EC.1.1.1.50)，是睾酮假单胞菌(comamonas pseudomonas testosteroni,CPT)产生一种类固醇脱氢酶。它可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C19-27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原反应。3α-HSD由225个氨基酸组成,分子量为26.4KD。3α-HSD应用到体外诊断试剂中，作为工具酶发挥其催化作用。例如，在总胆汁酸测定技术中，3α-HSD可以与Thio-NAD一起特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性辅酶(NADH)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(NAD)每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得总胆汁酸的含量。此外，在环境中众多类固醇激素物质的刺激下，睾酮假单胞菌大量表达3α-HSD，通过多酶的氧化甾核的复杂代谢途径，完全消化这类底物，因此3α-HSD在这些危害大的稳定化合物的生物修复中起重要作用。

现有的3α-HSD试剂溶液一般由三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、3α-HSD、EDTA.2Na和二价离子(MgCl_2、CaCL₂)等组成，其在实际应用中存在稳定时间较短的缺陷：在2-8℃开盖使用状态，测定结果准确性降低；在2-8℃密闭避光保存过程中，随着放置时间的延长，试剂颜色由无色逐渐变为红色，试剂在稳定性方面的这种缺陷，使得测定结果准确性降低，也造成原料的浪费，不能满足检测的要求。

因此有必要提供一种新的、稳定性高的3α-HSD溶液，以满足实际应用的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的3α-HSD试剂存在的稳定时间短的缺陷，提供一种在2-8℃开盖使用状态下和在2-8℃密闭避光存储过程中的持续稳定的3α-HSD试剂。

为达到以上目的，本发明提供了一种3α-HSD试剂，所述试剂的组成成分包括：

3α-HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2-(环己胺)乙磺酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸、N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸和三乙醇胺中的一种。

可选的，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚所组成的组中的一种或两种。

可选的，所述稳定剂选自半胱氨酸、L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽二钠盐和牛血清白蛋白所组成的组中的一种。

可选的，在所述试剂中，3α-HSD的浓度为0.5-100KU/L，优选为5-20KU/L；缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mmol/L；表面活性剂的浓度以质量体积百分含量计为0.05-20％(w/v)，优选为1-15％(w/v)；稳定剂的浓度为1-20g/L，优选为3-15mmol/L。

可选的，所述缓冲液的缓冲容量为0.05-1mol/L。

可选的，所述3α-HSD试剂的pH为8.0-9.5。

可选的，所述缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸，所述稳定剂为L-还原型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一种，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)和聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)中的至少一种。

本发明还提供了所述3α-HSD试剂的制备方法：将缓冲液、表面活性剂、稳定剂、3α-HSD依次加入到混合容器中进行分步混合，得到均匀的稳定相。

本发明还提供了所述3α-HSD试剂的应用，包括制备总胆汁酸测定试剂和酶体外定向分子进化技术的研究。

通过上述技术方案，本发明所提供的3α-HSD试剂在2-8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到15-30天；在2-8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。

具体实施方式