[发明专利]汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物技术检测领域，特别涉及汉坦病毒核酸检测试剂盒。

背景技术

    虫媒病是一类重要的传染病。近20年来，全球新发现的30多种传染病中，许多是由病媒生物传播的。目前我国法定的传染病有36种，其中鼠疫、肾综合征出血热、疟疾、登革热与登革出血热等13种疾病为虫媒病。这类疾病在我国每年传染病总发病病例中约占5%-10%，死亡数占传染病总死亡数的30%-40%。

    汉坦病毒（Hantavirus）是引起肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）的病原体，属布尼亚病毒科（Bunyaviridae）汉坦病毒属（Hantavirus）单股负链RNA病毒。目前，全球已有40多种不同分型的汉坦病毒，其中22个型的汉坦病毒可引起人类疾病。汉滩型汉坦病毒（HTNV）和汉城型汉坦病毒（SEOV）是引起我国HFRS 的主要病原体，啮齿动物是汉坦病毒的主要宿主。

    近半个世纪以来，肾综合征出血热严重危害我国人民健康和生命安全。20世纪50年代共发生3568例、60年代23164例、70年代143949例、80年代696074例、90年代488330例。病死率从1980年的6.4%降至1993年的1.6%。该病至今仍在我国东北及环渤海地区广泛流行，尚无特殊的治疗方法及特效药。

    随着国际贸易和旅游业的发展，病媒生物及其携带的病原体可借助交通工具、集装箱、货物等在国际间传播。使原本局限于一定地域内的虫媒病突破国境或自然地理的界限，在全球范围内广泛传播与流行，对输入国的卫生安全特别是口岸地区的卫生安全造成极大的威胁。

    鼠类是出入境交通工具中常见的媒介生物之一，可随飞机、轮船等载体在国境口岸之间扩散。历史上多次发生由于鼠类入境造成疫病暴发流行的事例。1898年，一艘汽船将染有鼠疫耶尔森菌的褐家鼠（Rattus norvegicus）从印度带到了马达加斯加岛，褐家鼠在该岛大量繁殖，使当地鼠疫频繁发生。近年来，我国卫生检疫机构在北京、上海、宁波、成都等口岸的入境飞机、轮船、集装箱中查获大量的鼠类。鼠类 的输入对我国国境口岸的卫生安全构成严重威胁。

    加强对啮齿动物等，尤其是输入性鼠类进行汉坦病毒检测是对汉坦病毒进行预防、控制的基础和前提，汉坦病毒检测方法主要有血清学检测和核酸检测，血清学检测主要有免疫荧光测定（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析试纸条等。随着分子生物学技术的不断发展，核酸检测技术被越来越多的应用到病原检测中来，该技术具有较高的敏感性，尤其适合于病毒载量低的样品。

核酸检测主要包括引物设计、反应体系和反应条件优化、核酸扩增、电泳凝胶检测和结果分析等。如果没有预先的储备，一名熟练的实验室工作人员从接收样品到准备、检测和分析，需一周左右的时间。如果无法及时获取阳性样品对反应组成、反应条件进行探索，上述时间将明显延迟或根本进行检测。

发明内容

    本发明的目的是解决汉坦病毒检验检疫问题，提供一种汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，试剂盒简单实用，特异性强，敏高性高，使用者只需将处理后的样品加入反应管中，即可进行扩增反应。

    本发明汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，包括汉坦病毒巢式PCR第一轮及巢式PCR第二轮反应体系，其中PCR第一轮反应体系包括一对通用引物HTV－MFO、HTV－MRO；PCR第二轮反应体系包括汉城型引物SEO-MF、SEO-MR和汉滩型PCR引物HMF、HMR，引物序列如下：

所述PCT第一轮为RT-PCR反应体系，总体积为50 μL， 包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2×Buffer 25.0 μL，模板RNA 2-14 μL，引物HTV－MFO (20 μM) 2.0 μL，引物HTV－MRO (20 μM)2.0 μL，补充RNase Free H₂O使总体积达到50 μL；

所述PCR第二轮汉城型反应体系总体积为50 μL，包括DNA  Polymerase (1U/μl) 2.0 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，4×dNTP 5.0 μL， 模板4.0 μL（RT-PCR），引物SEO-MF(20μM)2.0 μL，引物 SEO-MR (20 μM)2.0 μL，补充ddH₂O 30.0 μL，使总体积达到50 μL；