[发明专利]汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，其特征是：包括汉坦病毒巢式PCR第一轮及巢式PCR第二轮反应体系，其中PCR第一轮反应体系包括一对通用引物HTV－MFO、HTV－MRO；PCR第二轮反应体系包括汉城型引物SEO-MF、SEO-MR和汉滩型PCR引物HMF、HMR，引物序列如下：

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2.根据权利要求1所述的汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，其特征是：所述PCT第一轮为RT-PCR反应体系，总体积为50 μL， 包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2×Buffer 25.0 μL，模板RNA 2-14 μL，引物HTV－MFO (20 μM) 2.0 μL，引物HTV－MRO (20 μM)2.0 μL，补充RNase Free H₂O使总体积达到50 μL；

所述PCR第二轮汉城型反应体系总体积为50 μL，包括DNA  Polymerase (1U/μl) 2.0 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，4×dNTP 5.0 μL， 模板4.0 μL（RT-PCR），引物SEO-MF(20μM)2.0 μL，引物 SEO-MR (20 μM)2.0 μL，补充ddH₂O 30.0 μL，使总体积达到50 μL；

所述PCR第二轮汉滩型反应体系总体积为50 μL，包括DNA  Polymerase (1U/μL) 2.0 μL， 10×PCR Buffer 5.0 μL， 4×dNTP 5.0 μL，模板4.0 μL， 引物HMF (20μM)2.0 μL，引物HMR (20μM)2.0 μL，补充ddH₂O 30.0 μL，使总体积达到50 μL。

3.汉坦病毒集成式核酸检测方法，其特征是：

（1）汉坦病毒核酸检测引物的设计与合成：以汉坦病毒M片段设计并合成RT-PCR通用外引物HTV－MFO、HTV－MRO，扩增片段大小为445 bp；汉城型PCR引物SEO-MF、SEO-MR，扩增片段大小为417 bp；汉滩型PCR引物HMF、HMR，扩增片段大小为382 bp，引物序列如下：

（2）PCR反应体系的建立：

RT-PCR反应体系为50 μL， 包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2×Buffer 25.0 μL，模板RNA 2-14 μL，引物HTV－MFO (20 μM) 2.0 μL，引物HTV－MRO (20 μM)2.0 μL，补充RNase Free H₂O使总体积达到50 μL；将RT-PCR反应体系的混合液，模板RNA除外，分装至200 μL PCR管中并置于冰箱中，-20 ℃及以下冷冻3 h以上，将PCR管置于冻干机内进行真空干燥处理3h，保存于-20℃冰箱中待用；

PCR第二轮汉城型反应体系为50 μL，包括DNA  Polymerase (1U/μl) 2.0 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，4×dNTP 5.0 μL，模板4.0 μL（RT-PCR），引物SEO-MF(20μM)2.0 μL，引物 SEO-MR (20 μM)2.0 μL，补充ddH₂O 30.0 μL，使总体积达到50 μL；将PCR第二轮汉城型反应体系的混合液，模板除外，分装至200 μL PCR管中并置于冰箱中，-20 ℃及以下冷冻3 h以上，将PCR管置于冻干机内进行真空干燥处理3h，保存于-20℃冰箱中待用；

PCR第二轮（汉滩型）反应体系为50 μL，包括DNA  Polymerase (1U/μL) 2.0 μL， 10×PCR Buffer 5.0 μL， 4×dNTP 5.0 μL，模板4.0 μL， 引物HMF (20μM)2.0 μL，引物HMR (20μM)2.0 μL，补充ddH₂O 30.0 μL，使总体积达到50 μL；将PCR第二轮汉滩型反应体系的混合液，模板除外，分装至200 μL PCR管中并置于冰箱中，-20 ℃及以下冷冻3 h以上，将PCR管置于冻干机内进行真空干燥处理3h，保存于-20℃冰箱中待用；

（3）实时荧光定量PCR反应：RT-PCR反应条件包括50℃ 30min；94℃ 3min ，94℃ 20 s，54℃ 30s，72℃ 30s，40 cycles；72℃ 5min；

PCR第二轮汉城型反应条件包括94℃ 3min ；94℃ 15 s，53℃ 25s，70℃ 25s，38 cycles；70℃ 5min；

PCR第二轮汉滩型反应条件包括94℃ 3min；94℃ 15 s， 56℃ 25s，72℃ 25s，35 cycles；72 ℃ 5 min。

4.    根据权利要求3所述的汉坦病毒集成式核酸检测方法，其特征是：对汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒进行评价，包括敏感性、特异性、重复性及稳定性评价：

    所述敏感性评价采用的方法及结果是：将RT-PCR反应体系用RNase Free H₂O复溶，或根据加入模板RNA的情况减少RNase Free H₂O加入量，使反应总体系为50 μL；将待检模板用RNase Free H₂O作10倍系列稀释，按原反应组成、反应条件进行检测试验；以能够检出阳性样品的最低浓度为该试剂盒的检测下限，即敏感度； 

所述特异性评价采用的方法及结果：用本发明的汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒检测登革病毒（Ⅰ型）、登革病毒（Ⅱ型）、登革病毒（Ⅲ型）、登革病毒（Ⅳ型）、西尼罗病毒、流行性乙型脑炎病毒；

    所述重复性评价采用的方法及结果：从同批次制备的试剂盒中，分别随机抽取20套装有混合试剂的PCR管，各平分为两组，分别检测阳性样品和阴性样品，进行3批次试验；

    所述稳定性评价采用的方法及结果：在不同的温度条件下（常温、4℃和-20℃）保存试剂盒，一定时间后检测同一浓度的阳性和阴性样品并与原检测结果比对，观察试剂盒的稳定性；将检测试剂盒在常温、4℃和-20℃条件下分别保存7天、30天和1年，试剂盒对相应样品的检测结果没有明显的变化。