[发明专利]一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法

说明书

本发明涉及一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法。该方法包括如下步骤：(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经过滤，去除菌体，制得澄清液；(2)向澄清液中流加稀盐酸，室温静置，弃上清液，制得浆状流体；(3)向浆状流体中加入萃取剂，搅拌均匀，萃取，离心后，经有机膜微滤，制得滤液；(4)将滤液在‑25～‑10℃的条件下结晶，经微滤过滤去除结晶，制得抗菌脂肽溶液。本发明首次公开了低温冷冻环境储存环境条件下，萃取体系中的无机盐可以充分析出，析出微滤后的有机溶液再次低温冷冻储存时不会再发生结晶现象，可以解决目前抗菌脂肽制备过程中杂质盐不易取出的难题。

技术领域

本发明涉及一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，属于抗菌肽纯化技术领域。

背景技术

抗菌脂肽(antimicrobial lipopeptide)是抗菌肽(antimicrobial peptide)的一种，一般是革兰氏阳性杆菌产生的代谢产物。抗菌脂肽的分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，抗菌脂肽除了抗菌活性之外还具有表面活性剂的特性。在生物医药、农业、石油开采、食品及化妆品和环境治理等领域，抗菌脂肽有着重要的应用前景，已引起广泛的关注。

目前已经发现的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬介素(fengycin)、伊枯草菌素(iturins)、杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。

解淀粉芽孢杆菌的发酵产物经过酸沉、乙醇萃取和脱盐、水相置换等浓缩纯化操作，使用液质联用检测，发现分子量为994Da、1008Da、1022Da、1036Da，与目前文献报道的表面活性素的分子量相吻合，经鉴定，解淀粉芽孢杆菌表达的抗菌脂肽为表面活性素(surfactin)。

表面活性素，由β-羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨基酸上的羧基和脂肪酸的β-羟基缩合形成环状结构。肽链中典型的氨基酸组成顺序为(L-)Glu-(L-)Leu-(D-)Leu-(L-)Val-(L-)Asp-(D-)Leu-(L-)Leu，其分子结构式如下：

从该分子结构式中可以看出，氨基酸组分包含中性的亮氨酸、缬氨酸和酸性的谷氨酸、天冬氨酸，在发酵过程中生成的主要是谷氨酸和天冬氨酸的钾盐形式，因此该物质的分泌使得发酵过程中pH升高。

目前抗菌肽方面主要的研究重点均集中于以下三个方面：

1、各类抗菌肽基因的构建、电转、鉴定和筛选的分子生物学过程；

2、抗菌肽的人工化学合成以及天然抗菌肽的化学提取法；

3、抗菌肽作为杀虫剂、饲料添加剂以及各类昆虫抗菌肽的有效成分的深加工和应用。鲜有报道抗菌脂肽浓缩纯化和脱盐的专利。至今，国内没有抗菌脂肽表面活性素发酵液适合中试、大规模的微滤用膜、低温脱盐的发酵下游后处理方法。

南京农业大学的陆兆新、艾嘉等人使用高压液相建立了一套准确可信的检测抗菌脂肽的方法，在制备较纯的标准品过程中，对提取方法进行了优化，如图7所示。

但上述方法仅适用于实验室验证，存在无法大规模应用、有机溶剂毒性较大的问题，并且，由于抽提过程中不可避免掺入了少量水，盐的存在使得抗菌脂肽在储存过程中更容易水解，在向其他有机相转换过程中容易出现结晶沉淀；在定性检测时有脱尾峰现象，从而最终产品纯度不高。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽的有机溶液中脱盐的方法。

发明概述