[发明专利]一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法。

背景技术

蕨类植物(Fern)又称羊齿植物，在形态结构和环境的适应能力方面，介于苔藓植物和种子植物之间的一大过渡植物类群，在植物进化系统中占有重要的地位。鸟巢蕨(AspleniumnidusL.)属真蕨目(Eufilicales)铁角蕨科(Aspleniaceae)巢蕨属(Asplenium)，不仅是居室观叶植物的重要组成部分和作为地被植物被用于构建多样化的园林景观，还具有较高的食用价值和药用价值。鸟巢蕨在热带森林生态系统中也发挥着重要作用，体现在对森林生态系统的水分与养分循环的调节、丰富并维持森林生物多样性等方面。虽然鸟巢蕨具有一定的经济价值和生态价值，但其分子生物学研究进展缓慢。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，在DNA水平上反映植物遗传基础的差异，是植物遗传育种领域内的一项新技术。简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)是一类由1～6个核苷酸为基本单位的串联重复DNA序列，分布于真核生物基因组的编码区和非编码区。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态性高、重复性好、信息量大、共显性遗传等特点，且成本低、检测容易、操作简单，被广泛应用于植物遗传育种研究。然而使用该技术的前提是要有相应的SSR标记，首先要从研究材料中获取重复序列两侧的序列信息，设计引物后才能被利用。根据序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSR(GenomicSSR，gSSR)和表达序列标签SSR(ExpressedsequencetagSSR，EST-SSR)。EST-SSR是基于EST序列开发的SSR标记，避免了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用现有转录组测序数据开发标记，具有成本低、效率高等优点。EST-SSR标记来源于基因组中的表达序列，直接反映基因的表达信息，在不同物种间具有良好的通用性。

近年来，快速增长的EST数据为开发EST-SSR标记提供了快速、有效和廉价的途径。随着第二代高通量测序技术的成熟，转录组测序产生的EST序列数量与日俱增，这为SSR标记的开发提供了更丰富的可利用数据资源。由于高通量测序产生的数据量极其巨大，需要对大量EST序列进行格式处理、剔除冗余序列等仍是一个很大的工作量。Perl是一种自由且功能强大的编程语言，被用作Web编程、数据库处理、XML处理以及系统管理等。随着生物信息学的发展，Perl被应用到了生物数据的操作和检索中，使得对大批量数据统一处理成为了可能。在此基础上进行EST-SSR引物开发更能提高查找效率，节约时间和减少资金。

目前，鸟巢蕨尚无全基因组序列信息，关于其SSR引物数量非常有限。对于无参考基因组的物种来说，采用高通量测序技术对其转录组进行分析，将测序所得的序列拼接成转录本，以转录本作为参考序列，进行后续分析。因此，利用第二代高通量测序技术获得鸟巢蕨转录组序列信息，批量开发EST-SSR引物，将会对蕨类种质资源鉴定、遗传多样性、重要性状基因定位及分子标记辅助选择育种等起重要推动作用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其包括以下步骤：

1)构建转录组文库：提取鸟巢蕨叶片总RNA，分离mRNA，反转录合成并纯化cDNA，末端修复、加腺嘌呤核苷连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200～700bp的片段，将回收片段进行PCR扩增，即构建得到转录组文库；

2)转录组数据的获得：将步骤1)得到的转录组文库用IlluminaHiSeq^TM2000平台进行测序，采用Illumina双末端测序方法，获得转录组测序数据；利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；

3)SSR位点查找：

安装Perl语言，从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载est_trimmer.pl并运行以去除所述转录组序列中小于100bp的短序列和大于2000bp的长序列；

从http://www.bioinformatics,org/cd-hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；